Simulabukspyttkjertel Neuroplasticity:<em> In Vitro</em> Dual-nevron Plasticity analysen
Summary
Nevronale plastisitet er en stadig mer anerkjent, men ikke tilstrekkelig forstått funksjonen av mage (GI) tarmkanalen. Her, i eksempelet med menneskelige bukspyttkjertelen lidelser, presenterer vi en in vitro nevroplastisitet analysen for studiet av nevronale plastisitet i mage-tarmkanalen på både morfologisk og funksjonelt nivå.
Abstract
Neuroplasticity er et iboende trekk ved den enteriske nervesystem og gastrointestinal (GI) innervasjon i henhold til patologiske tilstander. Men den patofysiologiske rolle nevroplastisitet i GI lidelser er fortsatt ukjent. Nye eksperimentelle modeller som tillater simulering og modulering av GI nevroplastisitet kan muliggjøre økt forståelse av bidraget av nevroplastisitet særlig GI sykdommer som kreft i bukspyttkjertelen (PCA) og kronisk pankreatitt (CP). Her presenterer vi en protokoll for simulering av bukspyttkjertelen nevroplastisitet under in vitro forhold og med nyfødt rotte dorsal root ganglia (DRG) og myenteric plexus (MP) nevroner. Denne dual-nevron tilnærming ikke bare tillater overvåking av både orgel-egenverdi og-ytre nevroplastisitet, men også representerer et verdifullt verktøy for å vurdere neuronal og glial morfologi og elektrofysiologi. Dessuten blir funksjonell modulering av medfølgende microenviron innholdet for å studere deres IMPACt på nevroplastisitet. Når etablert, bærer den foreliggende neuroplasticity assay potensial til å være anvendbar i studiet av neuroplasticity i enhver GI organ.
Introduction
Endringer i gastrointestinal (GI) nerve morfologi og tetthet har fanget oppmerksomheten til gastroenterologer og patologer i lang tid, men deres relevans for patofysiologien av GI sykdommer forblir ukjent 1-3. Faktisk er flere svært vanlige GI lidelser som gastritt, reflux øsofagitt, kolitt, divertikulitt, og blindtarmbetennelse assosiert med økt innervasjon tetthet i betent vev områdene en. Imidlertid har ingen ekte oppmerksomhet så langt blitt betalt til de mekanismer og betydningen av nevroplastisitet i mage-tarmkanalen. Må morfologisk endrede GI nerver skiller seg fra vanlige GI nerver, dvs. normal tilstand av det enteriske nervesystemet, i form av sin funksjon? Hva er konsekvensene av endrede neuropeptide / nevrotransmitter innhold i plast enteriske nerver? Har perifer nevroplastisitet alltid innebære endret signale til sentralnervesystemet? Og hvor er de sentrale projeksjoner av plast extrinsic GI nervebaner? En lang rekke slike viktige spørsmål kan lett bli generert når man ser på det sparsommelige vår kunnskap om de funksjonelle aspektene av GI nevroplastisitet.
Studiet av GI nevroplastisitet på funksjonelt nivå krever gyldige, reproduserbare og fortsatt lett gjeldende eksperimentelle modeller. I en tid med økende popularitet og aksept av genmodifisert betingede musemodeller (GECoMM), som for in vivo innstillinger bære potensial til å belyse tidligere ukjente fasetter av GI nevroplastisitet på en realistisk måte en. Men, utforming og produksjon av GECoMM koster fortsatt, arbeidskrevende og spesielt tidkrevende. Videre krever de a priori valg av målet for å bli betinget modulert i genetisk manipulert mus (f.eks transgen overekspresjon av nervevekstfaktor / NGF i enteriske epitelceller). Derfor, for desIGN av en vellykket GECoMM, forskere trenger noen indikatorer (f.eks tidligere eksperimentelle data) av et verdig mål, det vil si at molekylet av interesse (her NGF) kan i det minste forventes å utøve noen biologisk relevante effekter på GI nerver.
Slike indikatorer kan lett bli avledet fra tilfredsstillende in vitro-modeller hvor isolerte celle-subtyper fra komplekset mikromiljøet av en in vivo-system kan selektivt cocultured i en heterotypic måte 4-7. Modulering av molekylære mål i en slik heterotypic kultur innstillingen er på gjennomsnittlig teknisk mindre tungvint, raskere, og kan derfor hjelpe til prefiltering mot verdige mål for verifisering i di vivo studier.
Nylig presenterte vi en in vitro nevroplastisitet analysen som er designet for å simulere økt nevral tetthet og hypertrofi av intrapancreatic nerves i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen (PCA) og kronisk pankreatitt (CP) vev. Her ble nevroner avledet fra nyfødt rotte dorsal root ganglia (DRG) eller myenteric plexus (MP) som utsettes for vevsekstrakter fra kirurgisk reseksjon PCA eller CP vev prøver og sammenlignet med de som dyrkes i normal menneskelig bukspyttkjertelen (NP) vevsekstrakter fem. I stedet for vevsekstrakter, kan man også bruke cellelinje supernatants å studere virkningen av utvalgte celletyper på nevroplastisitet. Når den kombineres med et standardisert morfometrisk måling, tillater frem neuroplasticity analysen gyldig, og reproduserbar evaluering av neuronal plastisitet i respons til forskjellige pancreatic microenvironments. Spesielt, gjør det simulering av en) morfologisk nevroplastisitet, dvs. endringer i neurite utvekst, forgrening mønster og nevronale størrelse, og 2) funksjonell nevroplastisitet, dvs. endringer i oppstemthet av perifere nerveceller. Videre har ikke bare perifert (dvs. </em> Enteric), men også av typen (f.eks DRG eller andre ordens spinal) nevroner kan inkluderes i foreliggende analyse for å vurdere deres morfologisk og funksjonell reaksjon på forskjellige GI vev innhold. I den aktuelle videoen opplæringen, vi demonstrere den tekniske protokollen for utførelsen av denne analysen og diskutere sine fordeler og svakheter. Videre vil vi presisere anvendelsen av den grunnleggende begrep i denne analysen til studiet av neuroplasticity i enhver GI organ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nåværende protokollen er ment å illustrere metodikken bak in vitro bukspyttkjertelen nevroplastisitet analysen som nylig ble utviklet av vår gruppe for å studere mekanismene for nevroplastisitet i PCA og CP fem. Protokollen innebærer en tre-dagers prosedyre som enkelt kan påføres etter at utøveren har fått tilstrekkelig erfaring i isolasjon og kultur av DRG og MP nevroner. Videre representerer det et verdifullt verktøy for å studere samtidig reaksjon av ente og DRG-assosiert gliacelle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle forfattere bidratt til etablering og validering av det fremlagte analysen og til utkastet til manus.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
Riferimenti
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
