Simulering Pancreas Neuroplasticitet:<em> In Vitro</em> Dual-neuron Plasticitet Assay
Summary
Neuronal plasticitet er en stigende grad anerkendt, men utilstrækkeligt forstået funktionen af mave (GI) tarmkanalen. Her i eksemplet af menneskelige pankreassygdomme præsenterer vi et in vitro neuroplasticitet analyse til studiet af neuronal plasticitet i mave-tarmkanalen på både morfologiske og funktionelle niveau.
Abstract
Neuroplasticitet er et iboende træk ved det enteriske nervesystem og gastrointestinal (GI) innervation under patologiske tilstande. Men den patofysiologiske rolle af neuroplasticitet i GI lidelser er fortsat ukendt. Nye eksperimentelle modeller, der tillader simulering og modulering af GI neuroplasticitet kan muliggøre øget anerkendelse af det bidrag neuroplasticitet især GI sygdomme såsom kræft i bugspytkirtlen (PCA) og kronisk pancreatitis (KP). Her præsenterer vi en protokol til simulering af pancreas neuroplasticitet under in vitro-betingelser under anvendelse af nyfødt rotte dorsalrodsganglier (DRG) og plexus myentericus (MP) neuroner. Denne dobbelte-neuron tilgang ikke kun tillader overvågning af både orgel-iboende og-ydre neuroplasticitet, men repræsenterer også et værdifuldt redskab til at vurdere neuronal og glial morfologi og elektrofysiologi. Desuden giver det funktionelle modulering af medfølgende microenvironmental indhold for at studere deres impact på neuroplasticitet. Når de er etableret, den nuværende neuroplasticitet analysen bærer potentiale for at være anvendelig til studiet af neuroplasticitet i enhver GI orgel.
Introduction
Ændringer i gastrointestinal (GI) nerve morfologi og tæthed har fanget opmærksomheden af gastroenterologists og patologer i lang tid, men deres relevans for patofysiologien af GI-sygdomme er fortsat ukendt 1-3. Faktisk er flere meget almindelige GI lidelser såsom gastritis, refluxesophagitis, colitis, diverticulitis og blindtarmsbetændelse forbundet med øget innervation tæthed i betændte væv områder 1.. Der er dog ikke ægte opmærksomhed hidtil blevet udbetalt til de mekanismer og betydningen af neuroplasticitet i mave-tarmkanalen. Må morfologisk ændrede GI nerver afviger fra normale GI nerver, dvs normale tilstand af det enteriske nervesystem, i form af deres funktion? Hvad er konsekvenserne af ændrede neuropeptid / neurotransmitter indhold i plast enteriske nerver? Er perifer neuroplasticitet altid medføre ændret signalering til det centrale nervesystem? Og hvor er de centrale fremskrivninger af plast extriNSIC GI nervebanerne? En lang række af sådanne centrale spørgsmål kan nemt blive genereret, når man ser på manglen på viden om funktionelle aspekter af GI neuroplasticitet.
Studiet af GI neuroplasticitet på funktionsniveau kræver gyldige, reproducerbare og stadig let anvendelige eksperimentelle modeller. I en tid med stigende popularitet og accept af gensplejsede betingede musemodeller (GECoMM), såsom in vivo-indstillinger bærer potentialet til at belyse hidtil ukendte facetter af GI neuroplasticitet på en realistisk måde 1. Men design og produktion af GECoMM stadig dyrt, arbejdskrævende og især tidskrævende. Desuden kræver de a priori valg af mål, der skal betinget gradueres på genetisk ændret mus (fx transgene overekspression af nerve vækstfaktor / NGF i enteriske epitelceller). Derfor, for desIGN af en vellykket GECoMM, forskerne har brug for nogle indikatorer (f.eks tidligere eksperimentelle data) af et værdifuldt mål, nemlig at molekylet af interesse (her NGF) mindst kan forventes at udøve nogle biologisk relevante virkninger på GI nerver.
Sådanne indikatorer kan nemt udledes passende in vitro-modeller, hvor isolerede celle undertyper fra komplekset mikromiljø et in vivo system kan selektivt samdyrket i heterotypisk måde 4-7. Gradueringen af molekylære mål i sådan en heterotypisk kultur indstilling er i gennemsnit teknisk mindre besværlig, hurtigere, og kan derfor støtte i forfiltrering af værdifulde mål for verifikation i in vivo-undersøgelser.
For nylig præsenterede vi et in vitro neuroplasticitet assay, som var designet til at simulere den øgede neurale tæthed og hypertrofi af intrapankreatiske nerves i bugspytkirtelkræft menneske (PCA) og kronisk betændelse i bugspytkirtlen (CP) væv. Her blev neuroner afledt fra nyfødt rotte dorsalrodsganglier (DRG), eller plexus myentericus (MP) udsættes for vævsekstrakter fra kirurgisk resektion PCa eller CP væv prøver og i forhold til de dyrkes i normal human pancreas (NP) vævsekstrakter 5. I stedet for vævsekstrakter, kan man også bruge cellelinje supernatanter at undersøge virkningen af udvalgte celletyper om neuroplasticitet. Når det kombineres med et standardiseret morfometrisk måling, præsenterede neuroplasticitet Analysen tillader gyldig og reproducerbar vurdering af neuronal plasticitet som reaktion på forskellige pancreas mikromiljøer. Især giver det simulering af 1) morfologisk neuroplasticitet, dvs ændringer i neuritudvækst, forgrening mønster og neuronal størrelse, og 2) funktionelle neuroplasticitet, dvs ændringer i ophidselse af perifere neuroner. Desuden er det ikke kun perifert (dvs. </em> Enterisk), men også centrale (fx DRG eller anden orden spinal) neuroner kan indgå i det foreliggende assay for at vurdere deres morfologiske og funktionelle reaktion på forskellige GI væv indhold. I den nuværende video tutorial, vi demonstrere den tekniske protokol for udførelsen af denne analyse og diskutere sine fordele og svagheder. Derudover henleder vi opmærksomheden på anvendeligheden af den grundlæggende opfattelse af denne analyse til studiet af neuroplasticitet i enhver GI orgel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol er beregnet til at illustrere den metode bag in vitro pancreas neuroplasticitet assay som for nylig blev udviklet af vores gruppe til at studere mekanismerne i neuroplasticitet i PCa og CP 5.. Protokollen indebærer en tre-dages procedure, som let kan anvendes, når den udøvende kunstner har fået tilstrækkelig erfaring i isolering og dyrkning af DRG og MP neuroner. Desuden repræsenterer et værdifuldt værktøj til at studere samtidig reaktion af enteriske og DRG-associere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle forfattere har bidraget til etablering og validering af den præsenterede analyse og til udkastet af manuskriptet.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
Riferimenti
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
