Bu prosedür, IR floresan in farelerde kollagen yeniden faaliyetleri görüntüleme hem de denatüre edilmiş kolajen sarmalları ile melezleşmek için verilmedi tetiklenen olabilir kafesli kollajen mimetik peptitler kullanılarak, doku kesitlerinde kolajenlerin ex vivo boyanması yakın in vivo gösterilmiştir.
Kollajen doku oluşumu ve bakım destekleyen hücre dışı matrisin önemli bir yapısal bileşendir. Kollajen yeniden normal doku yenilenmesi ayrılmaz bir parçası olmasına rağmen, yeniden aktivitesinin aşırı miktarda tümörler, artrit ve diğer birçok patolojik şartlarda yer almaktadır. Kollajen yeniden sırasında, kollajen moleküllerinin üçlü sarmal yapının hücre dışı ortamda proteazlar tarafından bozulur. Buna ek olarak, pek çok histolojik doku numuneleri içinde bulunan kollajen kısmen sabitleme ve muhafaza işlemleri ile denatüre edilir. Bu nedenle, bu denatüre kolajen iplikler biyolojik görüntüleme için etkin hedefler olarak hizmet edebilir. Daha önce verilmedi tetiklenen kolajenlerin özgüdür üçlü sarmal yapı oluşturarak denatüre kollajen şeritler ile hibridize olabilir kafesli bir kollajen peptidini mimetik (CMP) geliştirdi. Bu işlemin genel hedefler denatüre kollajen iplikçikler r görüntüye) i vardırin vivo olarak, normal yeniden faaliyetlerinden esulting ve ii) verilmedi tetiklenen kafesli cmps kullanılarak ex vivo doku kesitlerinde in kolajenleri görselleştirmek için. Etkili melezleme ve in vivo ve ex vivo görüntüleme başarılı elde edilmesi için, floresan etiketli Kafesli CMPS verilmedi-aktif ya da damar içi enjeksiyon hemen önce, ya da doğrudan doku bölümleri üzerinde aktif hale gelir. Sabitlenmiş bir fare kornea doku kesitlerinde çıplak fareler ve kollajen liflerin normal iskelet kollajen remolding bu prosedürde görüntülenmiş. Burada yer alan CMP-kollajen hibridizasyon teknolojisine dayalı bir görüntüleme yöntemi, doku yeniden modelleme süreci daha iyi anlaşılmasına yol açan, hem de yüksek bir kollajen yeniden aktivitesi ile bağlantılı hastalıklar için yeni teşhis geliştirilmesini izin verebilir.
Kollajen, memelide en bol bulunan protein, proliferasyonunu ve hücre farklılaşmasını destekleyerek doku gelişimi ve rejenerasyonda önemli bir rol oynar. Lifli kolajenler (örneğin tip I, II), bağ dokularda dokulara mekanik mukavemet verirken, ağ-benzeri kolajen (IV tipi) hücreleri takmak ve organize dokulardan bazal membran temel iskelesi oluşturur. Kolajen kollajen yeniden bozulmasını (proteazlar tarafından) ve sentez (büyüme faktörleri tarafından teşvik) hem de içerir. Kollajen yeniden, kemik, örneğin, normal doku yenileme işlemi, fazla yeniden aktivitesi veya anormal yerlerde oluşun bir parçası olmasına rağmen, genellikle yara gösteren bir yaralanma ya da kanser, osteoporoz, artrit gibi kronik patolojik koşullara yanıt iyileştirici ve fibroz 1-4. Doğrudan görüntü kollajenleri in vivo biçimlenme geçiyor yeteneği ilerleme anlaşılmasına neden olabilirBu hastalıkların iyon, hem de yeni teşhis ve tedavi. Örneğin, canlı bir görüntüleme şiddeti ve hastalıkların konumu hakkında bilgi sağlar ve aynı zamanda yeni terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Multiphoton lazer tarama mikroskobu ve ikinci harmonik üretimi canlı farelerde 5 tümör hücre dışı matris yeniden izlenmesi için görüntü fibril kolajenlerin uygulanmıştır. Ancak, bu teknik invaziv bir işlemdir ki, şeffaf dorsal deri kıvrım odaları ile monte edilecek hayvanlar gerektirir. Kollajenin yeniden Doğrudan ve noninvaziv görüntüleme özellikle biçimlenme geçiyor kolajen hedefleyen bir prob yararlanacaktır. Bu prob bu da normal dokular 6 bol olan sağlam ve olgun kolajenlerin gelen yeniden kolajenleri ayırt etmek gerekir çünkü hazırlamak zordur.
Kollajen olan üçlü helis adlandırılan son derece nadir protein yapısı oluşurörneğin kollajen yeniden sırasında matris metaloproteinaz (MMP) olarak proteazlar tarafından ayrılır. Ayrıldı, kollajen fragmanlarının kendi üçlü sarmal yapısını kaybeder ve daha özel olmayan proteazlar tarafından sindirilir 1 katlanmamış şeritler (jelatin) hale gelir. Yakın zamanda, üçlü sarmal yapısına katlanması için bir eğilime sahip olması, kollajen taklit peptid (CMP) özel olarak bir ya da ısı denatürasyonu ile ya da enzimatik bozulmaya 1.7 tarafından üçlü sarmal durumundan ayrışmış kollajen ipliklerini hedef olabilir keşfedilmiştir. Bağlanma, birincil olarak monomerik cmps ve denatüre edilmiş kolajen şeritlerin arasındaki üçlü sarmal hibridizasyonu ile tahrik edilir. CMPS kollajen melezleme, bir kafes CMP için biraz itici kuvvet ile oda sıcaklığında homotrimeric üçlü sarmaldan içine kendini monte çünkü [(GPO) 4 NB GPO (GPO) 4, NB (GPO) 9 olarak belirlenmiş, O: hidroksiprolin] geliştirildi hangi fotoğraf bölünebilir nitrobenzili içeriyorgrubu (NB) peptidin merkezi glisin eklenmiş. NB kafes grubu sterik olarak üçlü sarmal içine katlanır gelen CMP önler, ama UV ışınlaması ile kafes grubunun çıkarılması hemen üçlü sarmal kollajen katlama ve hibridizasyon 1 tetikler. Yakın kızılötesi (NIR) flüoroforlar ile etiketlenmiş monomerik CMPS sistemik fareler model teslim edilir, onlar özellikle hedef ve normal (örneğin kemik ve kıkırdak) geçiren dokularda ve patolojik (örn. tümörlerde) 1 remodellinglerinde denatüre kolajenlerin in vivo görüntüleme izin verebilir .
Floresan etiketli CMPS, aynı zamanda histolojik doku kesitlerinde in kolajenleri görüntülenmesi için kullanılabilir. Histolojik çalışmada, hasat dokusu sık sık hücresel bileşenleri ve bozulmalara karşı genel doku morfolojisi tutmak için tespit ile korunur. Isı ve organik çözücüler ile tedavi, kimyasal çapraz linkin içerir sabitleme işlemleri,g reaktifler (örneğin paraformaldehit), kolajen 8'deki üçlü sarmal yapısını denatüre. Bu, denaturasyon CMP hibridizasyon için bölgeler oluşturur. O floresan etiketli cmps spesifik olarak, hatta daha etkili bir fibrotik karaciğer dokularında 9 patolojik koşulların belirlenmesi kolay izin verilen bir anti-kollajen antikoru, daha sabit bir doku kesitlerinde in kolajenlerin için (örneğin, deri, kornea, kemik ve) bağlanabildiği gösterilmiştir. CMP kolajenlerin her türlü için ortak olan üçlü helis motifi amino asit sekansını ihtiva eden denatüre kolajen şeritleri hedefliyor. Bu nedenle CMP geniş spektrumlu bir kolajen boyama madde olarak kabul edilebilir. Burada, floresan etiketli kafesli cmps kullanılarak in vivo denatüre kolajen şeritleri ve ex vivo doku kesitlerinde in ii) görselleştirme kolajenleri görüntüleme i) için ayrıntılı deneysel prosedürler mevcut. A NUR etiketi, IR680, canlı görüntüleme, whil için kafesli CMP konjuge edildiE carboxyfluorescein (CF), standart floresan mikroskoplar ile uyumluluk için doku boyama çalışmalarında kullanılmıştır. Bu protokol kollajenin yeniden ile ilgili olarak CMPS görüntüleme uygulaması üzerinde duruluyor. CMP sentezi için yöntemler, daha önceki raporlarda 1,7,9-15 bulunabilir. Bu ekran raporda, normal farelerde ve fare kornea dokusu bölümlerinde görüntüleme iskelet dokular gösteri amacıyla seçilmiştir, burada sunulan yöntemler hali hazırda olduğu gibi, kollajen yeniden (örneğin, tümörler, yara iyileşmesi) içeren pek çok patoloji ve biyolojik modeller uygulanabilir Ancak iyi kolajenleri içeren hemen hemen her öneki doku numunesi olarak.
Bu protokolde görülebileceği gibi kafesli cmps UV-etkinleştirme ortak kuyruk damarından enjeksiyon protokolleri 19 için tek ek bir adım olduğu için, CMP teslim basittir. Anahtar bir Uncaged ve meta-kararlı tek kordonlu halde peptit probları enjekte etmektir. Kafes grup kendi kendine düzeneğinden CMP engeller ve CMP üçlü sarmal halinde katlanmasına başladığı noktada UV ışığı ile çıkarılır kadar kolajenler (Şekil 2B) bağlanması. Enjeksiyon formülasyon hızlı bir şekilde en aza indirmek için bir toksisite şekilde UV ışınlaması sırasında yarılmış kafes grubu ile tepkimeye girebilen, sistein içerir. Farklı suşları (örneğin, SKH-1 ve DR-1) ile çok sayıda farenin bu formülasyon kullanılarak test edilmiş ve altı aya kadar bu farelerde herhangi bir davranış ya da sağlık kusurları tespit etmedi. Enjeksiyon UV ışınlarına maruz hemen sonra takip etmezse, CMPS hiçbir melezleme kapasitesine sahip olduğu, homotrimeric üçlü sarmaldan içine kat edecek. Şekil 2C enjeksiyondan önce CMPS tamamen uzun gecikme süresi (> 2 gün) ile üçlü sarmaldan takıldı edildi aşırı durum göstermektedir. Bu sorunu aşmak için, CMP solüsyon nispeten düşük bir konsantrasyonda (örneğin ~ 40 uM) hazırlandı ve hemen UV-decaging sonra farelere enjekte edilmelidir. Çünkü seyreltik koşullarda CMPS yavaş üçlü sarmal katlanır oranı (sarmallamanın yarım saati:> 50 dk) ve kısa UV ışınlarına maruz kalma ve enjeksiyon süresi (5 ~ 7 dakika toplam), CMPS çoğunda tek kan dolaşımına Bu protokol takip edildiğinde formu iplikçik. Konsantrasyon, yeniden toplama oranı 18 dramatik azalmasına yol açan, kan havuzu içinde 20 kat azaltılır gibi bir kez enjekte edilmiş, CMPS, tek şeritler olarak kalması beklenmektedir. Enjeksiyon gecikir (örn. hayvan taşıma için) ve homotrimeric doğallaşım şüpheleniliyorsa, kısmen monte peptidler 70 üzerinde ısıtılarak sokulabilir76; C istemi soğutma ve enjeksiyon ardından tek-lifler, için CMPS ayırmak. Daha az elverişli olsa da, bu tür ısı ile ayrışmış cmps da (Şekil 2B) in vivo hedeflenmesinde beklenen sonuçları göstermektedir.
NIR sinyalin% 50'ye varan saç tarafından bloke edilebilir, çünkü bu tanıtımda, çıplak farenin NIR flüoresan görüntüleme için kullanılmıştır. Saçlı fare modellerinde (siyah kıllar özellikle olanlar) ile çalışırken, biz bir elektrikli tıraş makinesi veya saç çıkarıcı kullanarak önce görüntüleme ilgi bölgesinde fareyi tıraş öneririz. Şekil 1 'de, hayvan diyet klorofil otomatik floresans neden olduğu hayvanın karın bölgesi, yanlış pozitif sinyaller vardır. Bu arka plan sinyalleri önemli ölçüde yaklaşık 4 gün önce görüntüleme saflaştırılmış diyetler için fareyi geçerek düşürülebilir. Şekiller 1 ve 2A 'de görüldüğü gibi, güçlü CMP yutaklar kuyruk spin vardıre. Bu nedenle, mükemmel olmayan bir kuyruk ven enjeksiyonları kaynaklanan sonuçları engellemek için, enjeksiyon yerinde floresan görüntü yakalanan değildir, böylece kuyruk arka kısmında enjekte önerilir.
Etiketli CMP başka yöntemler kullanılarak tespit edilmesi zor olan in vivo kolajen yeniden belirli konumların hedefleme ve görüntüleme sağlar. Örneğin, ELISA-temelli kan ve idrar analizleri yarılmış telopeptid kollajen fragmanları için duyarlıdır ancak bu Çözülebilir antijenleri hedef için bir yöntem olup, kolajen devir kaynağını tespit edemez. NIR kullanarak in vivo görüntüleme tekniğinin temel sınırlamalar hemoglobin 680/710 nm NIR boyaların bir endojen söndürücü olarak CMPS yakın toplanmış kırmızı hücreleri tarafından derinliği penetrasyon zayıflama ve söndürme işaretlenmiştir. In vivo görüntüleme CMP geleceği uygulamaları doğrudan gama yayan radyoaktif ya da pozitron emi ile etiketlenmiş cmps kullanılarak SPECT veya PET görüntüleme dahiltters, kollajen remodeling (örneğin osteoporoz, artrit, ateroskleroz, ve fibrozis) ilgili hastalık durumlarının teşhis için. Bu radyo-etiketli CMP analoglan doku derinliği ve toplanmış kırmızı hücrelerin varlığı nedeniyle sinyal kaybı sınırlamaları ortadan kaldırır ve hastalıklı dokuların niceliksel ölçümler sağlayacaktır. Buna ek olarak, görece geç görüntüleme süresi (örneğin 48-96 HPI) CMPS yavaş bağlanma ve açıklık kaynaklanan zor kollajenin yeniden hızlı değişimleri takip yapabilir. Böyle bir sınırlama bağlayıcı kinetik ve CMP görüntüleme ajanları afinite daha mühendisliği ile aşılabilir. CMP küçük bir yapıya sahip denatüre kolajenlerin bağlanan bu yana, CMP-kollajen bazlı görüntüleme yalnızca görüntü kolajen lifleri 5 ikinci harmonik üretimi mikroskopi tamamlayıcıdır.
Floresan etiketli CMPS ile doku bölümleri boyama, biz bunu yararlı kuluçkaya bulundu4 ° C de UV-aktif peptit Çözeltilerin örnekleri üçlü sarmal melezleştirme düşük bir sıcaklıkta 1,20 da kolaylaşır çünkü. Ayrıca, boyama kavanoza taze PBS tamponu içinde slaytlar çeker sadece örnek üzerinde yıkama tamponları pipetle çok daha iyi çalıştığı, bağlanmamış cmps yıkamak için en etkili yol olduğu bulunmuştur. CMP-kollajen lif hibridizasyon çok özel ve sağlam olan ve bu nedenle bu video yer alan basit boyama protokolü kolaylıkla ilave belirteçler costaining değiştirilmiş ve sabitlenmemiş doku bölümlerinde bozulmuş kolajenleri belirlenmesi için olabilir. Bu çeşitli histolojik örneklerde lifli kolajenleri tespit etmek için bir anti-kollajen antikorların kullanıldığı için etkili ve uygun bir alternatiftir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, teknik yardım için Gilbert Yeşil ederiz. Bu çalışma MGP layık NIAMS / NIH (R01-AR060484) ve DOD (W81XWH-12-1-0555) SmY verilen gelen ve NIH (U24 CA92871 ve U54 CA151838) hibe tarafından desteklenmiştir
IRdye 680RD Maleimide (IR680) | LI-COR | 929-71050 | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere1 |
5(6)-Carboxyfluorescein | Sigma | 21877-5G-F | Used for CMP labeling, protocol presented elsewhere12 |
Cysteine | Advanced Chemtech | YC2200 | |
Isoflurane | Butler Veterinary Supply | 4/4/5260 | |
Goat Serum | Sigma | G9023-10ML | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A9647 | |
DAPI | Roche Applied Science | 10236276001 | |
Fluoroshield mounting medium | Sigma | F6182-20ML | |
Equipment | |||
Syringes | BD | 329461 | |
UV lamp | McMaster-Carr | 1447T17 | |
Pearl impulse imager | LI-COR | 9400 | |
Surgical forceps and scissors | |||
EasyDip slide staining system | Light Labs | M900-12B | |
20-place cardboard microscope slide tray | Light Labs | ||
Cover glasses | Fisher | 12-545-c | |
Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-E |