Undersöka effekterna av probiotika på Pneumococcal Colonization Använda en<em> In Vitro</em> Adherensanalysen
Summary
In vitro följsamhet analyser kan användas för att studera fastsättning av Streptococcus pneumoniae till epitelceller monolager och för att undersöka möjliga åtgärder såsom användning av probiotika för att hämma pneumokocker kolonisation.
Abstract
Vidhäftning av Streptococcus pneumoniae (den pneumokocker) till epitelial slemhinnan i nasofarynx kan resultera i kolonisering och anses vara en förutsättning för pneumokockinfektioner såsom lunginflammation och öroninflammation. In vitro adherence analyser kan användas för att undersöka vidhäftningen av pneumokocker till epitelceller monolager och för att undersöka möjliga åtgärder, såsom användning av probiotika, att hämma pneumokock kolonisering. Protokollet som beskrivs här används för att undersöka effekterna av den probiotiska Streptococcus salivarius på vidhäftningen av pneumokocker i människo epitelcellinje CCL-23 (ibland kallad HEp-2-celler). Analysen omfattar tre huvudsteg: 1) beredning av epitel och bakterieceller, 2) Förutom av bakterier till epitelceller monolager, och 3) upptäckt av fastsittande pneumokocker med bakterieräkning (seriespädning och plätering) eller kvantitativ realtids-PCR (qPCR ). Denna technique är relativt enkelt och inte kräver annat än en vävnadsodlingsinställningsspecialutrustning. Analysen kan användas för att testa andra probiotiska arter och / eller potentiella hämmare av pneumokocker kolonisation och kan lätt modifieras för att ta itu med andra vetenskapliga frågor om pneumokocker vidhäftning och invasion.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus) är en grampositiv bakterie, som kan orsaka infektioner, inklusive lunginflammation, otitis media, och meningit. Det är en viktig orsak till sjukdom hos barn i låginkomstländer och ansvarig för uppskattningsvis 800.000 dödsfall bland barn under fem års ålder varje år 1. Pneumokocker sker ofta i nasofarynx av småbarn. Även om denna kolonisering anses allmänt asymtomatiska, föregår den pneumokockinfektion och tjänar som en reservoar för bakterierna i mänskliga populationer 2. Konjugerat pneumokock vaccinering minskar effektivt transport av de serotyper som ingår i vaccinet. Men det finns mer än 90 serotyper av pneumokocker, och vaccination kan leda till serotyp ersättning, varvid elimineringen av vaccinets serotyper följs av en uppgång i vagn och sjukdom orsakad av nonvaccine serotyper 3. Också i vissa högriskpopulationer, pneumokockerkolonisering sker ofta mycket tidigt i livet, före administrering av den första vaccindosen 4,5. På senare tid har användningen av probiotika föreslagits som en ytterligare strategi för att hämma pneumococcal colonization 6,7. In vitro adherence analyser har använts för att undersöka pneumococcal adherence 8,9. Dessa analyser har anpassats för att undersöka effekterna av den probiotiska Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) på pneumokock följsamhet 10.
Utöver LGG och andra mjölksyrabakterier, Streptococcus salivarius, en gemensam hemvist i den orala kaviteten, har undersökts som en potentiell probiotisk för luftvägarna på grund av sin kolonisering potential och förmåga att inhibera pneumokocker och andra respiratoriska patogener in vitro 11 – 13. Protokollet presenteras här beskriver en följsamhet analys som används för att undersöka effekterna av S. salivarius K12 på pneumococcal adherencetill den humana epitelcellinje CCL-23. Före användning i analysen, var pneumokock isolat utvärderades för vidhäftningsförmåga, som tillväxt-och vidhäftningsförmåga kan variera kraftigt mellan isolat 10,14. Tillväxtkurvor av pneumokocker och S. salivarius utfördes för att bestämma mitten av log-fasen och uppskattning koncentration (kolonibildande enheter eller CFU / ml) av den optiska densiteten (OD, figur 1). Det rekommenderas att undersöka tillväxten av viabla celler och OD för varje isolat före användning i analysen. Denna analys kan utföras i alla laboratorier med standardvävnadsodlings anläggningar och utrustning. I detta protokoll, effekten av tre doser av S. salivarius administreras 1 h före tillsats av pneumokocker på vidhäftningen av S. pneumoniae PMP843, en serotyp 19F vagn isolat kommer från en nasofarynxpinne, undersöks. Två olika sätt att kvantifiera vidhäftande pneumokocker presenteras: plätering på blodagar att avskräckamin livsdugliga räkningar, och DNA-extraktion och detektion av pneumokock LytA genen från qPCR 15. Den grundläggande adherence analysprotokoll kan lätt modifieras för att testa olika doser eller tiden för administrering av probiotika och kan även användas tillsammans med andra bakteriestammar eller arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk del av denna analys är att lägga till lämpliga koncentrationer av S. salivarius och pneumokocker i avsnitt 3.1.7 och 3.1.12. Halterna beräknas med hjälp av OD-avläsningar, men den exakta inokulat bestäms inte förrän plattorna räknas följande dag. Därför rekommenderar vi att du utför tillväxtkurvor för att mäta OD och bakterieräkning (CFU / ml) över tid för alla bakteriestammar som används i analysen för att identifiera mitten log fas och hjälpa till att uppskatta koncentration …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av medel från Murdoch Childrens Research Institute och den viktorianska regeringens Operational Infrastruktur Support Program.
Materials
| Minimum Essential Media (MEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30244.01 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30084.03 | ||
| T-75 Flask | Nunc | 156472 | ||
| CCL-23 cells | ATCC | CCL-23 | ||
| Trypsin | Life Technologies | 15090046 | ||
| 24-well cell culture plate | Nunc | 142475 | ||
| Horse blood agar (HBA) plates | Oxoid | PP2001 | Sheep blood agar plates also acceptable | |
| Todd-Hewitt Broth | Oxoid | CM0189 | ||
| Yeast Extract | Beckton Dickinson | 212750 | ||
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | ||
| Disposable cuvettes | Kartell | 1938 | ||
| Heparin | Pfizer | 2112105 | comes in sterile ampules at 5,000IU/5mL | |
| sterile spreader | Technoplas | S10805050 | alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ||
| Mutanolysin | Sigma-Aldrich | M9901 | ||
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | ||
| SDS 20% solution | Ambion | AM9820 | ||
| RNase A | Qiagen | 19101 | ||
| QIAamp DNA mini-kit (250) | Qiagen | 51306 | ||
| LytA F primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA | |
| LytA R primer | Sigma-Aldrich | Custom made | 5' -> 3' sequence TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT | |
| LytA probe | Eurogentec | Custom made | 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used | |
| Nuclease free water | Ambion | AM9906 | ||
| Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix | Agilent Technologies | 600880 | ||
| Thermo-Fast 96 Detection plate | Thermo Fisher Scientific | AB-1100 | ||
| Ultra clear qPCR cap strips | Thermo Fisher Scientific | AB-0866 | ||
| Mx3005 QPCR System | Agilent Technologies | 401449 | ||
| * alternative sources are available for most/all products listed | ||||
Riferimenti
- O’Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
- Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
- Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
- Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
- Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
- Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
- Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
- Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
- Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
- Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
- Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
- Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
- Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
- Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
- Carvalho, M. d. G. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
- Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
- Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
- Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).
