अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स की आनुवंशिक हेरफेर<em> इन विट्रो</em> और<em> में Vivo</em> Neuronal आकृति विज्ञान और प्रवास का अध्ययन करने के लिए
Summary
Neuronal morphogenesis और माइग्रेशन उचित मस्तिष्क विकास अंतर्निहित महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं. यहाँ, हम आनुवंशिक रूप से संवर्धित अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स और आकृति विज्ञान और न्यूरॉन्स के प्रवासी विशेषताओं के मूल्यांकन के लिए विकासशील सेरिबैलम में हेरफेर करने की विधियों का वर्णन.
Abstract
Neuronal morphogenesis और माइग्रेशन सहित मस्तिष्क में विकासात्मक घटनाओं अत्यधिक इन विट्रो. प्रक्रियाओं करवाया और vivo में इन घटनाओं में शामिल रास्ते की पहचान करने के लिए एक में गहराई लक्षण वर्णन के लिए अनुमति विश्लेषण कर रहे हैं. विकासशील सेरिबैलम से निकाली गई है कि अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स (CGNs) रूपात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है कि एक आदर्श मॉडल प्रणाली रहे हैं. यहाँ, हम एक अनुवांशिक CGNs हेरफेर करने के लिए की विधि और कैसे व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की axono और dendritogenesis अध्ययन करने का वर्णन है. इस विधि के साथ शाही सेना हस्तक्षेप, overexpression या छोटे अणुओं के प्रभाव न्यूरॉन्स को नियंत्रित करने के लिए तुलना की जा सकती. इसके अलावा, कृंतक अनुमस्तिष्क प्रांतस्था ने अपने प्रमुख प्रसव के बाद विकास के कारण इन विवो प्रणाली में एक आसानी से सुलभ है. हम भी आनुवंशिक रूप से विकासशील cerebella हेरफेर और बाद अनुमस्तिष्क वर्णन करने के लिए एक में vivo electroporation तकनीक पेश neuronal आकारिकी एक आकलन करने के लिए विश्लेषण करती हैएन डी प्रवास.
Introduction
सेरिबैलम अक्षतंतु विकास और प्रवास के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम है. सेरिबैलम तंत्रिका विज्ञान 1 की सुबह से ही शरीर रचना का अध्ययन का विषय रहा है. आधुनिक माइक्रोस्कोपी और immunohistochemical तकनीक काफी विस्तार और सैंटियागो, रेमन, और Cajal 2-4 से प्रारंभिक खोजों परिष्कृत किया है. माउस आनुवंशिकी और आणविक पढ़ाई अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन्स (CGNs) 5-7 सहित न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के उचित तारों के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण घटनाओं की अधिक से अधिक समझने के लिए नेतृत्व किया है, जो अनुमस्तिष्क विकास के नियंत्रण में आवश्यक विकास और प्रतिलेखन कारक खुला.
सेरिबैलम विकासशील पश्चमस्तिष्क 8 rhombomere 1 के व्युत्पन्न है. 4 वें वेंट्रिकल की छत का हिस्सा है जो विषमकोण होंठ, में सबसे अनेक neuronal आबादी का गठन होगा जो अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल न्यूरॉन progenitors, को जन्म देता हैवयस्क सेरिबैलम 9. विजय – स्तम्भ प्रवास के बाद, वे अनुमस्तिष्क मूलरूप में बसा. इधर, छोटा दाना न्यूरॉन व्यापारियों के पिंजरे का बँटवारा कृन्तकों में postnatally जगह लेता है, जो बाहरी बारीक परत (EGL), के नाटकीय विस्तार की ओर जाता है. EGL से, न्यूरॉन्स Purkinje सेल परत अंततः आंतरिक बारीक परत (आईजीएल 2) में निवास को लेने के लिए अतीत, आणविक परत (माले) के माध्यम से आवक पलायन शुरू करते हैं. इस प्रवासी प्रक्रिया के दौरान, वे दो axons एमएल में देने के साथ एक द्विध्रुवी आकार हासिल. आगे प्रवास पर, सेल शरीर दूर axons से migrates और दो प्रक्रियाओं एक बंटवारा, टी के आकार अक्षतंतु 10 के लिए फार्म का फ्यूज. बाद में, इन axons स्तबकमय और के रूप में समानांतर फाइबर में भेजा जाता है. आईजीएल में बसे, CGNs कोईदार फाइबर के साथ synapses स्थापित करने के लिए वृक्ष के समान पंजे जो फार्म डेन्ड्राइट, बढ़ता है. , विकासशील सेरिबैलम में मौलिक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक इन विट्रो और इन विवो approac में संयुक्तज विश्वसनीय परिणाम और निष्कर्ष के लिए अनुमति देता है.
CGNs न केवल सेरिबैलम की बल्कि पूरे मस्तिष्क का सबसे अनेक न्यूरॉन्स होते हैं और उच्च शुद्धता 11-13 को संवर्धित किया जा सकता. संस्कृति में, यह अत्यधिक सजातीय neuronal आबादी तेजी से postmitotic हो जाता है और आसानी से पहचाना axons और dendrites के साथ एक ध्रुवीय आकारिकी प्राप्त. संवर्धित CGNs पूर्वज प्रसार, भेदभाव, axonal और dendrite विकास, neuronal प्रवास, apoptosis और electrophysiological गुण (14-19 और कई अन्य) सहित neuronal विकास के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अत्यंत उपयोगी साबित किया है. आनुवंशिक हेरफेर का उपयोग सुसंस्कृत CGNs की बहुमुखी प्रतिभा का विस्तार किया और aforementioned घटनाओं में आगे यंत्रवत अंतर्दृष्टि के लिए अनुमति दी गई है. कम दक्षता कैल्शियम फॉस्फेट या ध्रुवता मार्कर या सॉफ्टवेयर का समर्थन विश्लेषण सुविधाओं के साथ immunocytochemistry द्वारा पीछा lipophilic तरीकों का उपयोग कर सभ्य न्यूरॉन्स के अभिकर्मकएक घने neuronal संस्कृति में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के जैसे आकृति विज्ञान का मूल्यांकन tates. इस दृष्टिकोण के साथ, अक्षतंतु या dendrite विकास में ब्याज की प्रोटीन की भूमिका 20-25,26-28 का अध्ययन किया जा सकता है. इस संस्कृति प्रणाली हालांकि प्रवास बहुत उच्च घनत्व संस्कृतियों में सीमित है के रूप में neuronal प्रवास का विश्लेषण करने के लिए कम उपयोगी है और cocultures की आवश्यकता होगी. अक्षतंतु और dendrite विकास की इन विट्रो विश्लेषण भी शाही सेना हस्तक्षेप (मैं) के संयोजन का उपयोग कर एक संकेतन मार्ग की परस्पर प्रोटीन की परीक्षा के लिए अनुमति देता है, अधिक अभिव्यक्ति या छोटे अणुओं.
अक्षतंतु और dendrite विकास विनियमन या neuronal प्रवास में ब्याज की प्रोटीन की प्रासंगिकता को स्थापित करने के लिए, vivo electroporation (Ive) तकनीक विकसित अनुमस्तिष्क प्रांतस्था में विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. कृन्तकों में अनुमस्तिष्क विकास पहले दो प्रसव के बाद सप्ताह में जिस तरह फैली हुई है कि इस तथ्य के कारण, सेरिबैलम एक accessib का प्रतिनिधित्व करता हैaxons और dendrites, neuronal प्रवास, synaptogenesis और apoptosis 20-24,29,30,26,27,31-34 के विकास की जांच करने के लिए आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए ले मस्तिष्क संरचना. इसके अलावा, इस मॉडल प्रणाली को भी इस तरह के अक्षतंतु pathfinding, तारों और साथ में ले ली न्यूरॉन्स और न्यूरॉन glia बातचीत की कनेक्टिविटी के रूप में बरकरार अनुमस्तिष्क प्रांतस्था की आवश्यकता है कि neuronal विकास के अन्य पहलुओं के लिए उपयोगी है, इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो और इन विवो तकनीक से निपटने के लिए में प्रदान करता है neuronal morphogenesis और प्रवास के बारे में एक पूरक दृष्टिकोण.
Protocol
Representative Results
Discussion
फायदे और इन विट्रो और इन विवो तरीकों में वर्णित की सीमाएं:
माउस और चूहों से सुसंस्कृत CGNs समान रूप से अच्छी तरह से रूपात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. एक चूहा सेरिबैलम के बड़े आकार के क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ मदद के लिए, उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए सी. हैमर और एस Papiol एन Schwedhelm-Domeyer धन्यवाद. हमारा काम मैक्स प्लैंक सोसायटी, ड्यूश Forschungsgemeinschaft, नेनो पैमाने माइक्रोस्कोपी के लिए केंद्र, और मस्तिष्क के आण्विक फिजियोलॉजी (CNMPB), गौटिंगेन, जर्मनी और गौटिंगेन विश्वविद्यालय के GGNB जूनियर ग्रुप वजीफा द्वारा द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
| SP2 confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
| Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
| 50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
Riferimenti
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