Нейронов морфогенез и миграция являются важными события, лежащие в основе правильного развития мозга. Здесь мы описываем методы, чтобы генетически манипулировать культивируемые мозжечка гранул нейронов и развивающийся мозжечок для оценки морфологии и миграционных характеристик нейронов.
Развивающие события в мозге в том числе нейронов формообразования и миграции высоко организованы процессы. В пробирке и в естественных анализирует позволяют для характеризации углубленного выявления путей, вовлеченных в эти события. Мозжечка гранул нейроны (КСГН), которые получены из развивающихся мозжечка являются идеальной моделью системы, которая позволяет морфологического анализа. Здесь мы опишем метод того, как генетически манипулировать КСГН и как учиться axono-и dendritogenesis отдельных нейронов. С помощью этого метода эффекты интерференции РНК, повышенной экспрессией или малых молекул может быть по сравнению с контрольными нейронов. Кроме того, грызун коры мозжечка является доступным в системе естественных условиях в связи с его преимущественным развитием послеродовой. Мы также представляем естественных условиях технику электропорации в генетически манипулировать развивающийся мозжечка и описать последующую мозжечка анализирует оценить нейронов морфологии Aй миграции.
Мозжечок является отличной системой для изучения механизмов роста аксона и миграции. Мозжечок является предметом анатомических исследований с незапамятных неврологии 1. Современная микроскопия и иммуногистохимические методы значительно расширили и уточнили первоначальные открытия, Сантьяго, Рамон, и Cajal 2-4. Генетика мыши и молекулярные исследования обнаружили существенный рост и транскрипционных факторов в контроле развития мозжечка, что привело к большему пониманию важнейших событий, необходимых для правильного подключения различных типов нейронов в том числе мозжечка гранул нейронов (КСГН) 5-7.
Мозжечок является производным ромбомере 1 развивающегося заднего мозга 8. Ромбическая губа, которая является частью крыши 4-го желудочка, приводит к мозжечка гранул нейронных клеток-предшественников, которые будут составлять самую многочисленную нейронов населения ввзрослых мозжечок 9. После ростральной миграции, они располагаются в коре зачатка. Здесь, митоз гранула нейронных предшественников приводит к резкому расширению внешнего зернистого слоя (EGL), который проходит после рождения у грызунов. Из EGL, нейроны начинают мигрировать внутрь через молекулярного слоя (ML), мимо слой клеток Пуркинье в конечном итоге поселяются во внутреннем зернистого слоя (IGL 2). Во время этого миграционного процесса, они приобретают биполярную форму с двумя аксоны, проходящий в ML. После дальнейшей миграции, тело клетки мигрируют от аксонов и эти два процесса сливаются, образуя один раздвоенный, Т-образные аксон 10. Впоследствии эти аксоны расположенный пучком и называются параллельными волокнами. Поселившись в IGL, КСГН расти дендриты, которые образуют дендритные когти установить синапсы с мшистых волокон. Чтобы исследовать фундаментальные процессы в развивающемся мозжечке, объединены в пробирке и в естественных условиях approacч позволяет надежных результатов и выводов.
КСГН не только самые многочисленные нейроны мозжечка, но из всей мозга и может быть культурным в высокой степени чистоты 11-13. В культуре, однако это весьма однородной нейронов население становится быстро постмитотическими и приобретает полярный морфологию с легко идентифицируемых аксонов и дендритов. Искусственный КСГН оказались чрезвычайно полезными для изучения различных аспектов развития нейронов включая пролиферацию предшественников, дифференциации аксонов и дендритов развития, миграции нейронов, апоптоз и электрофизиологических свойств (14-19 и многие другие). Использование генетических манипуляций расширила универсальность культивируемых КСГН и позволил для дальнейшего механистического понимания вышеупомянутых событий. Трансфекция культивируемых нейронов использованием низким кпд фосфат кальция или липофильные методы следуют иммуноцитохимии с полярностью маркеров или программного обеспечения при поддержке анализа FaciliTates оценку например морфологии отдельных нейронов в плотной нейронов культуры. При таком подходе роль представляющих интерес белков в аксонов или дендритов роста могут быть изучены 20-25,26-28. Эта система культуры, однако, менее полезны для анализа миграцию нейронов, как миграция очень ограничена в культурах с высокой плотностью и потребует совместных культурах. Анализ в пробирке аксона и роста дендритов также позволяет рассмотрении взаимосвязанных белков сигнального пути с использованием комбинации РНК-интерференция (I), сверхэкспрессии или малых молекул.
Для установления актуальность интересующего белка в аксона и регуляции роста дендритов или миграции нейронов, электропорации в естественных условиях (IVE) метод позволяет для анализа в развивающихся коры мозжечка. Благодаря тому, что мозжечковая развитие у грызунов проходит путь в первых двух недель постнатального, мозжечок представляет собой accessibструктура мозга ле для генетических манипуляций с целью рассмотрения развития аксонов и дендритов, миграцию нейронов, синаптогенез и апоптоз 20-24,29,30,26,27,31-34. Кроме того, эта модель системы также полезно для других аспектов развития нейронов, которые требуют неповрежденную коры мозжечка например аксона поиска пути, проводки и подключения нейронов и нейронов-глии взаимодействий, вместе взятых, этот протокол обеспечивает в пробирке и в естественных условиях методы для решения дополнительный подход в отношении нейронов формообразования и миграции.
Преимущества и ограничения описаны в пробирке и в естественных условиях методов:
Искусственный КСГН от мыши и крысы одинаково хорошо подходит для морфологического анализа. В связи с большим размером мозжечка крыс, выход АГНКС от крысят превышает щенков мыши 3-…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Н. Schwedhelm-Domeyer за отличную техническую помощь, С. Серп и С. Papiol за помощь в статистическом анализе. Наша работа финансируется за счет Общества Макса Планка, в Deutsche Forschungsgemeinschaft, Центра наноразмерных микроскопии и молекулярной физиологии головного мозга (CNMPB), Геттингене, Германия и по GGNB младшая группа стипендию в Геттингенском университете.
DMEM | Gibco | 11960-044 | |
BME | Gibco | 41010-026 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | Si-1-4011 | |
Poly-L-Ornithine | Sigma-Aldrich | P-2533 | |
CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
Isofluorane | Actavis Deutschland | ||
Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
ECM 830 and tweezertrodes | Harvard Apparatus | ||
Epifluorescence microscope and camera | Nikon | ||
SP2 confocal microscope | Leica | ||
ImageJ | NIH | ||
Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | ||
MS Excel | Microsoft | ||
Loading tip 1-200 µl | Costar | 4853 | |
Pipette tip 200 µl | Sarstedt | 70.760.502 | |
Microlance 3 needle, 30 gauge | BD | 302200 | |
50 µl gastight Syringe 1705 | Hamilton | ||
Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |