Ablation av en enda cell från åtta-cell Embryon av märlkräftan Kräftdjur<em> Parhyale hawaiensis</em

Summary

Märlkräftan Parhyale hawaiensis är en lovande modellorganism för studier av kräftdjur embryologi och jämförande leddjur utveckling och evolution. Detta protokoll beskriver en metod för manuell borttagning av enstaka blastomerer från klyvning stegsembryon tidiga av Parhyale.

Abstract

Märlkräftan Parhyale hawaiensis är ett litet kräftdjur som finns i tidvatten marina livsmiljöer i hela världen. Under det senaste decenniet har Parhyale vuxit fram som en lovande modellorganism för laboratoriestudier av utvecklingen, vilket ger en utgrupp jämförelse användbar för den väl studerade leddjur modellorganismen Drosophila melanogaster. I motsats till de syncytiala klyvningar av Drosophila, de tidiga klyvningar av Parhyale är holoblastic. Ödet kartläggning med hjälp av spår färgämnen injiceras i tidiga blastomeres har visat att alla tre groddblad och könsceller fastställs av åttacellstadiet. Vid detta steg är tre blastomerer förutbestämt att ge upphov till ektoderm, är tre förutbestämt att ge upphov till mesoderm, och de återstående två blastomerer är de förstadier i endoderm och könsceller respektive. Dock har blastomere ablation experiment visat att Parhyale embryon har också betydande reglerande capabilities, så att öden blastomerer borttagen vid åttacellstadiet kan tas över av ättlingar till några av de återstående blastomeres. Blastomere ablation har tidigare beskrivits av en av två metoder: injektion och efterföljande aktivering av fototoxiska färgämnen eller manuell ablation. Men fotoablation dödar blastomeres men tar inte bort den döda cellkroppen från embryot. Komplett avlägsnas fysiskt specifika blastomeres kan därför vara en föredragen metod för ablation för vissa tillämpningar. Här presenterar vi ett protokoll för manuell borttagning av enstaka blastomeres från åttacellstadiet av Parhyale embryon, illustrerar instrument och manuella förfaranden som krävs för fullständigt avlägsnande av cellkroppen samtidigt som de kvarvarande blastomeres levande och intakt. Detta protokoll kan tillämpas på alla Parhyale cell vid åttacellstadiet, eller till blastomerer av andra tidiga klyvningssteg. Dessutom, i princip detta protokoll kan tillämpas på tidig CleaVåge scen embryon av andra holoblastically klyva marina ryggradslösa djur.

Introduction

Märlkräftan kräftdjur Parhyale hawaiensis har vuxit fram under det senaste decenniet som en lovande modellorganism med stor potential för användning i evolutionär utvecklingsbiologi forskning ^1. Bland leddjur, de flesta modellsystem är insekter, och den mest omfattande av dessa är bananflugan Drosophila melanogaster. D. melanogaster är medlem i insektsordningen Diptera, och som sådan visar många embryologiska funktioner som härrör med hänsyn till de av basalt förgrenings insekter ^2. Dessutom är insekter kapslade i subphylum Pancrustacea ^3, vilket innebär att insekter har sina närmaste släktingar i den långvariga "naturlig" grupp som kallas pancrustaceans, och att denna grupp är paraphyletic. Detta tyder på att förutom basalt förgrening insektsmodeller, är studier av andra kräftdjur krävs för att få en bredare syn på evolutionen av de utvecklingsdrag ennd molekylära mekanismer som är så väl studerade i D. melanogaster. Men mycket få kräftdjur varit väl etablerad i experimentell laboratorieanalys av utvecklingen. Märlkräftan P. hawaiensis är en mycket lätthanterlig laboratoriemodellsystem, kan bli föremål för en rad olika experimentella tekniker. Märlkräftor visar många unika egenskaper i sin överordnade superorder Peracarida (strandloppor, Scuds och väl räkor), och därför tros vara relativt härledas inom denna grupp av kräftdjur. Trots det relativt lätt att embryologisk och funktionell genetisk manipulation som erbjuds av Parhyale göra detta märlkräfta ett värdefullt tillskott till nuvarande inventering av modellorganismer.

Som försöksdjur, P. hawaiensis erbjuder många fördelar. Djur är toleranta mot ett brett intervall av temperaturer och salthalter, och överlever bra i stora kulturer av artificiellt havsvatten ^1. Det är lätt att skilja mellaEen män och kvinnor som bygger på tydliga morfologiska skillnader, främst, de stora, krokiga, främre bålen bihang att män använder för att gripa honorna under parning. För embryologisk och utvecklingsarbete, P. hawaiensis har flera mycket tilltalande drag. Embryogenes varar cirka 10 dagar och tiden för könsmognad är cirka sex veckor vid 28 º C (men observera att Parhyale lever väl vid temperaturer mellan ca 20-30 º C, och den detaljerade utvecklings iscensättning information finns tillgänglig för embryon som tas upp vid 18 º C ⁴ , 25 º C ^4, och 26 º C ^5,6). Vuxna parar sig året runt i laboratoriet, så att embryon är tillgängliga när som helst på året. Honorna lägger 2-20 (beroende på kvinnans ålder) befruktade ägg i en ventral kull påse som ligger mellan de första par ben (figur 1a och 1b), och det är möjligt att samla dessa embryoväldigt tidigt i utvecklingen utan att döda den kvinnliga eller skada embryon (Figur 1C). De embryon överlever i filtrerat artificiellt havsvatten genom att kläckning, kan fastställas för efterföljande genuttryck eller histologisk analys ^7, samt en detaljerad iscensättning tabell möjliggör korrekt identifiering av de framsteg genom utveckling ^5. Robusta protokoll har använts för att utföra genuttrycksanalys med in situ hybridisering ^8-15 eller immunfärgning ^4,16,17, funktionell knockdown genom RNA-interferens ^13,15 eller morpholinos ^12, och stabil germinallinje genmodifiering ^18. Med hjälp av genmodifiering systemet, inducerbart uttryck ¹⁴ och förstärkare fälla ¹⁹ metoder kan också användas för att undersöka geners funktion i P. hawaiensis. Medan en offentligt tillgänglig arvsmassa finns för närvarande inte, en transkriptom innehåller avskrifter produceras under oogenes och embryogenes har been de novo monteras och kommenterad ^20, och deponeras i en sökbar databas ^21, underlättar gen upptäckt. Sammanfattningsvis P. hawaiensis är en mycket lätthanterlig modellorganism passar flera experimentella och genetiska metoder för att förstå utvecklingen.

Till skillnad från de tidiga syncytial klyvningar av D. melanogaster, P. hawaiensis embryon klyva holoblastically efter fertilisering (Figur 2A). Lineage tracing analys har visat att genom tredje klyvning, var och en av de tredje klyvnings blastomerer specifikt förutbestämt att ge upphov till en av de tre germinallager eller bakterielinjen ⁶ (figur 2B). Dessa uppgifter, tillsammans med microarraydata ^22, analyserar cell härstamning ^6,23, och blastomere isoleringsexperiment ⁴ har föreslagit att utvecklingspotentialen är segregerade till åtminstone vissa tredje klyvnings blastomeres genom asymmetrisk arv av cell öde bestämningsfaktorer. Följaktligen, blastomere ablation experiment där könscellerna prekursorn (benämnd "g" i Parhyale cellinje nomenklatur ⁶⁾ avlägsnades vid åtta cellstadiet, embryon saknade könsceller vid senare utvecklingsstadier ^4, såsom indikeras genom frånvaro av celler uttrycker proteinet Vasa, som är en bakterielinjen markör i de flesta metazoans ^24. Däremot somatiska blastomere ablation experiment visade att P. hawaiensis embryon har också betydande tillsynskapacitet, så att öden mesoderm och ektoderm prekursor blastomeres borttagen vid åttacellstadiet kan tas över av ättlingar till några av de återstående blastomeres ^25. Hur reglerande cell öde ersättare kan inträffa, och omfattningen av autonoma cellöde antar somatiska blastomeres, är okänd. Experimentella embryologiska tekniker såsom blastomere ablation kan vara användbara i förståelseding relativa autonomi och nonautonomy av cell öde beslut ^26,27 och är därför av intresse att studera P. hawaiensis embryogenes.

I de experiment som visade reglerande ersättning av ektodermala och mesodermala härstamningar, var blastomere ablation utförs av injektion ²⁸ och efterföljande excitation av fototoxiska färgämnen ^25. Även om denna teknik är effektivt på att döda den injicerade blastomere (s), är det inte helt ta bort den döda cellkroppen från embryot. Dessutom har skillnader observerats mellan cell härstamning data som samlats in genom att gastrulation stadier av embryogenes genom att injicera blastomeres med fluorescerande härstamning spårämnen ^28,29, och data som samlats in genom att följa ostörda blastomeres genom utveckling av samma embryonala stadierna ^23. Komplett avlägsnas fysiskt specifika blastomeres kan därför vara en föredragen metod för ablation för vissa tillämpningar.

Vi har tidigare publicerat resultaten av cell härstamning analyser av embryon där enskilda celler manuellt borttagen ^23. Men den känsliga åtgärder som behövs för att ta bort enstaka blastomeres från klyvning skede embryon tidigt har ännu inte beskrivits fullständigt. Här presenterar vi ett protokoll för insamling av P. hawaiensis embryon och manuell ablation av en enda blastomere från en åttacellstadiet embryo. Målet med denna metod är att uppnå fullständigt avlägsnande av cellkroppen från embryot, så att observation av de cellulära beteenden och cellöde behörigheten för de återstående celler under embryogenes och post-embryonal utveckling. Vår protokoll visar borttagande av könsceller gångaren g (figur 2C), men kan tillämpas på varje cell vid åttacellstadiet, eller till blastomerer av tidigare spaltningssteg. I princip skulle detta protokoll tillämpas på avlägsna enstaka celler från klyvning skede embryon början av Other holoblastically klyva marina ryggradslösa djur.

Protocol

Kommentarer som kan vara till hjälp för att utföra vissa steg anges i kursiv stil. 1. Dag 1: Beredning av material Förbered följande material (se tabell av material och utrustning): 15 cm och 22 cm Pasteur-pipetter Diamond rits filtrerades artificiellt havsvatten (salthalt mellan 0,0018-0,0020) innehållande 1 mg / ml amfotericin B (1:100 av en 100 mg / ml stamlösning), 100 enheter / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin (1:50 av en stamlösning innehå…

Representative Results

Efter framgångsrik ablation av enstaka tredje klyvning P. hawaiensis micromeres som beskrivs i detta protokoll, resterande micromeres gradvis flytta sina positioner en aning, för att delvis upptar det utrymme som tidigare ockuperats av den ablationsbehandlade blastomere. Till exempel, när g avlägsnas den angränsande blastomerer mr och ML förskjutas något och kommer att dela de laterala gränserna cell som tidigare var i direkt kontakt med g (jämför <st…

Discussion

Vi beskriver ett protokoll för manuell ablation och fullständigt fysiskt avlägsnande av enskilda blastomeres från tidiga klyvningsstadier märlkräftan P. hawaiensis. Vi demonstrerar användning av detta protokoll genom att ta bort den enda könsceller prekursorcell g från en åttacellstadiet embryo, och visa att ablation har varit framgångsrikt genom att bekräfta frånvaro av g: s dotterceller senare i embryogenes. Detta protokoll kan användas för att ta bort någon a…

Materials

15 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-630	For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. VWR
22 cm Pasteur pipette	Wheaton	53499-632	For making mouth pipette tips. VWR
3 cm petri dishes	Thermo Scientific	25382-334	Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. VWR
48-well plates	Greiner Bio-One	82051-004	For culturing embryos following ablation. VWR
Bottle top filters 0.2 micron	Nalge Nunc International	28199-296	For creating FASW (See below) VWR
Bunsen burner	VWR	89038-530	For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. VWR
Diamond scribe	Musco Sports Lighting	52865-005	For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. VWR
Forceps	Fine Science Tools	11050-10	For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps – the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. Fine Science Tools
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942	Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. Sigma Aldrich
Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)	World Precision Instruments	1B100-4	need to include glass capillary and needle puller machine? World Precision Instruments
Glass watchglass 300 mm diameter	Electron Microscopy Sciences	70543-30	For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. Electron Microscopy Sciences
Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)	Instant Ocean	IS160	Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. Aquatic EcoSystems
Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)	Instant Ocean	IS160	Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. Aquatic EcoSystems
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026	For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. VWR
Mouth pipette adaptor	Drummond Labware	A5177-5EA	Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Mouth pipette tubing	Aldrich	Z280356	Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. Sigma Aldrich
Needle Puller	Sutter Instrument Company	P97	For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. Sutter Instrument Company
Penicillin-Streptomycin Solution	Mediatech	45000-650	Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. VWR
Rubber bulb	Electron Microscopy Sciences	100488-418	For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. VWR
Sylgard 184	K. R. Anderson, Inc.	NC9659604	Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. Fisher Scientific
Tungsten wire 0.004 inches diameter	A-M Systems	719000	Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. A-M Systems