Lätt Mätning av diffusionskoefficienter av EGFP-taggade Plasma membranproteiner Använda k-Space Bild korrelationsspektroskopi
Summary
Detta dokument ger en steg för steg guide till fluktuationer analysteknik k-Space Bildcorrelation Spectroscopy (KI-grupper) för att mäta diffusionskoefficienter av fluorescerande plasmamembranproteiner i levande däggdjursceller.
Abstract
Lateral diffusion och uppdelning av plasmamembranproteiner är hårt reglerad i celler och på så sätt kommer att studera dessa processer visar nya insikter till plasmamembranprotein funktion och reglering. Nyligen, k-Space Bild Korrelation spektroskopi (KI-grupper) 1 utvecklades för att möjliggöra rutinmässiga mätningar av diffusionskoefficienter direkt från bilder av fluorescerande taggade plasmamembranproteiner, som undvek systematiska fel som införs genom sondfotofysik. Även om den teoretiska grunden för analysen är komplex, kan förfarandet genomföras genom nonexperts med hjälp av en fritt tillgänglig kod för att mäta diffusionskoefficienter i proteiner. KI-grupperna beräknar en tidskorrelationsfunktion från en fluorescensmikroskopi bildstapel efter Fourier transformation av varje bild till ömsesidig (k-) utrymme. Därefter cirkulär medelvärdes, naturliga logaritmen omvandla och linjär passar till korrelationsfunktionen ger diffusionskoefficienten. Dettapapper ger en steg-för-steg guide till bildanalys och mätning av diffusionskoefficienter via KI-grupperna.
För det första är en hög bildhastighet bildsekvens av en fluorescensmärkt plasmamembranprotein förvärvas med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Då är en region av intresse (ROI) undvikande intracellulära organeller, flytta blåsor eller utskjutande membranregioner som valts. ROI stack importeras till en fritt tillgänglig kod och flera definierade parametrar (se metod avsnittet) är inställda för KI-grupper analys. Programmet genererar sedan en "lutning på backen" plot från k-space tidskorrelationsfunktioner, och diffusionskoefficienten beräknas från lutningen på tomten. Nedan följer en steg-för-steg KICS förfarande för att mäta diffusionskoefficienten för ett membranprotein med användning av renalt vatten kanal aquaporin-3 etiketten EGFP som en kanonisk exempel.
Introduction
De fyra dimension Spatiotemporal organisation och rörlighet i sidled av plasmamembranproteiner är hårt reglerad och kan spela en roll i proteiners funktion, aktivitet och protein-proteininteraktioner. Lateral diffusion av plasmamembranproteiner, har traditionellt studerats genom att beräkna diffusionskoefficienter för enstaka partiklar från time-lapse avbildning av quantum dot eller färgämne märkta plasmamembranproteiner 2-4. Detta tillvägagångssätt kräver införing av en extracellulär tagg i plasmamembranprotein för quantum dot eller färgämnesmärkning, som kan kompromissa proteinveckning och funktion, och således kan inte uppnås för vissa proteiner. Den steriska volymen för en quantum dot har visat sig bromsa diffusionen av proteinet 5 och dessutom är det bara en liten del av proteinerna i populationen märkt med kvantprickar, och det är inte känt om denna fraktion är representativ för den totala pool av plasmamembranproteiner. Enstaka partikel tracking (SPT) mätningar av diffusionskoefficienter från bildserien av quantum dot märkta proteiner innebär kartläggning de avbildade topppositioner partiklarna med tvådimensionell Gauss passar följt av omfattande analysalgoritmer. Analysen är beräkningsmässigt mycket intensiv, kräver omfattande icke-linjär kurvanpassning i varje bildruta av en time-lapse-sekvens till approximationer av mikroskopet punktspridningsfunktion (normalt tvådimensionell rumslig Gaussians) och efterföljande länkning av partikelpositioner i partikelbanor som beskriver rörelse av enstaka molekyler 6,7.
En nyutvecklad bildkorrelationsteknik, k-Space Bildcorrelation Spectroscopy (KI-grupper) möjliggör relativt enkla mätningar av diffusionskoefficienter av fluorescerande taggade plasmamembranproteiner. Möjligheten att rutinmässigt beräkna diffusionskoefficienter av membranproteiner märkta med fluorescerande proteiner genom KI-grupperna är ett unikt verktyg som hållerflera fördelar jämfört med traditionella quantum dot SPT-analys: Det krävs ingen insättning av extracellulära taggar och tidskrävande extracellulär märkning (cellinjer som uttrycker fluorescerande proteiner kan användas); diffusionskoefficienter extraheras från den totala poolen av fluorescerande proteiner jämfört med en delmängd märkt med kvantprickar; Analysen är enkel utan behov av att spåra enstaka proteiner och analysen kan utföras med användning av en befintlig kod utan krav på ytterligare användarprogrammering. Metoden är snabb, eftersom det är en medelvärdesteknik som möjliggör snabb beräkning och beräkning av diffusionskoefficienter. Dessa snabba diffusion mätningar för protein befolkningen kompletterar den mer detaljerade molekylära transportinformation för en delmängd av populationen av de mödosamma SPT metoder.
KI-grupperna tid korrelerar fluorescens mikroskopi bildsekvenser som först har transformerats till Fourier-rymden, och därmed separerar fluorescence svängningar som beror på fotofysik från dem som på grund av molekylär transport 1. Som ett resultat kan KIG bestämma antalet täthet, flödeshastighet, och diffusion av fluorescensmärkta molekyler samtidigt som den är ett idealiskt genom komplexa fotoblekning eller blinkar av fluoroforerna. Detta gör KIG ett användbart verktyg för att snabbt bestämma de diffusion dynamiken i fluorescensmärkta cellmembranproteiner utan att behöva anpassade skriv algoritmer. Förutom fluorescerande proteiner kan KIG även appliceras på quantum dot-märkta membranproteiner 8.
Detta dokument ger en steg-för-steg införa hur man använder KI-grupperna för att extrahera diffusionskoefficienter av EGFP-märkta plasmamembranproteiner genom att visa hur man placerar grödan, hur man använder koden och hur man ska värdera de genererade tomter, där diffusion Koefficienterna extraheras. Som ett exempel kan data som erhållits genom spinning disk-mikroskopi uppsättning i semi-total inre reflektion fluorescerarnce (TIRF) läget av en njurvattenkanal protein aquaporin-3 (AQP3) taggade med EGFP presenteras.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dokumentet presenterades en detaljerad steg-för-steg överblick av hur man tillämpar KI-grupperna analysmetod för att bestämma diffusionskoefficienter från mikroskopi bilder av proteiner märkta med fluorescerande proteiner. Analysen är oberoende av sond val med ett mycket brett dynamiskt omfång i märkning densitet och kan därför också tillämpas på proteiner märkta med kvantprickar samt färgämnen och fluorescerande proteiner såsom EGFP.
För att beräkna giltiga diffusions…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en Lundbeck Junior gruppledare Fellowship till LNN. PWW erkänner bidragsfinansiering stöd från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC). Vi tackar också det danska Molekylär Bioimaging Center vid Syddansk Universitet för tillgång till spinning disk mikroskopi.
Materials
Riferimenti
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
