Shock Wave אפליקציות לסלולריים תרבויות
Summary
גלי הלם כיום ידועים אפקטי ההתחדשות שלהם. לכן בניסויים במבחנה הם עניין הולך וגובר. לפיכך, אנו פיתחנו מודל לניסויים במבחנה הלם גל (IVSWT) המאפשר לנו לחקות בתנאי vivo ובכך להימנע השפעות פיזיות מסיחות את הדעת.
Abstract
גלי הלם כיום ידועים אפקטי ההתחדשות שלהם. ממצאי מחקר בסיסיים הראו שגלי הלם שגורמים לגירוי ביולוגי למקד תאים או רקמות ללא כל נזק שלאחר מכן. לכן, בניסויים במבחנה הם עניין הולך וגובר. שיטות שונות של יישום גלי הלם על תרביות תאים כבר תיארו. באופן כללי, כל הדגמים הקיימים להתמקד איך ליישם הטוב ביותר גלי הלם על גבי תאים.
עם זאת, שאלה זו נותרה פתוחה: מה קורה לגלים לאחר שעבר את תרבית התאים? ההבדל של העכבה אקוסטית של מדיום תרבית התאים ואוויר הסביבה הוא כל כך גבוה, כי יותר מ 99% מגלי הלם מקבלים לידי ביטוי! לפיכך, אנו פיתחנו מודל המורכב בעיקר מיכל פרספקס בנוי המאפשר הגלים כדי להפיץ במים לאחר שעברו את תרבית התאים. זה ימנע תופעות cavitation, כמו גם השתקפות של הגלים שאחרת להפריע הקרובים אלה. Wiה מודל זה אנו מסוגלים לחקות in vivo תנאים וכך לקבל עוד ועוד ידע על איך הגירוי הפיזי של גלי הלם מקבל מתורגם לאותות ביולוגיים תא ("mechanotransduction").
Introduction
גלי הלם הם גלי לחץ קול הנובעים משחרור פתאומי של אנרגיה, למשל. כמו רעם כאשר ברקים. ברפואת גלי הלם היו בשימוש במשך 30 שנים בLithotripsy להתפוררות של אבנים בכליות. מאז הממצא הנלווה של עיבוי עצם הכסל בחולי Lithotripsy בתחילת 1980s, מחקרים ראשונים שנערכו על מנת להעריך את ההשפעה של טיפול גל הלם (SWT) על עצם ריפוי 1. תוצאות מרשימות של ריפוי משופר של nonunions ארוך עצם יכולה להיבחן 2. בהמשך לכך, הורחבו אינדיקציות לפצעים ברקמות רכים 3. ממצאי מחקר בסיסיים הראו שגלי הלם שגורמים לגירוי ביולוגי לרקמות היעד ללא כל נזק שלאחר מכן. שחרורו של גורמי גדילת angiogenic (למשל VEGF, PlGF, FGF) ואחריו אנגיוגנזה המשמעותית. זה הוביל להרחבה נוספת של אינדיקציות לכיוון פתולוגיות איסכמי. הקבוצה ואחרים שלנו הראו EFF החיוביect של SWT על מחלת לב איסכמית במודלים של בעלי חיים, כמו גם בניסויים קליניים 4-6.
עם זאת, המנגנון של איך הגירוי הפיזי של SWT מתורגם לאותות ביולוגיים (mechanotransduction) המדויק נשאר במידה רבה לא ידוע. כעניין בSWT ממספר תחומים של רפואת עליות ברציפות, את החיפוש אחר המכניזם הוא מקבל יותר ויותר אינטנסיבי. לכן, בניסויים במבחנה גל הלם צוברים חשיבות. חוץ מצמצום ניסויים בבעלי החיים ועלות משתלמת, היתרון הגדול ביותר של במבחנה טיפול בהלם גל (IVSWT) עשוי להיות האפשרות ללמוד את ההתנהגות הספציפית של סוג תא מסוים. בהתחדשות רקמות בתיווך גל הלם סביר להניח שכל התאים של הרקמה שטופלה מעורבים, גם תופעות מערכתיות הם דנו. עם זאת, כל סוג תא ממלא תפקיד מסוים ויש לו תפקיד המהותי משלה. IVSWT מאפשר לנו לזהות פונקציה מסוימת זהnd ובכך נותן לנו הבנה טובה יותר של התהליכים הבסיסיים המורכבים.
הידע של היום על ההשפעות של גל הלם בתרביות תאים כולל גידול של שגשוג, שינוי של קולטני קרום תא, עלייה והאצת התמיינות תאים, שחרור של גורמי גדילה והכימותרפיה משיכה, כמו גם נדידת תאים מוגברת 7-9.
השפעות פיזיות מסיחות את הדעת ברוב במודלים חוץ גופית שיטות שונות של יישום גלי הלם על תרביות תאים כבר תיארו. עובדה זו מובילה לבעיה שקשה מאוד להשוות את התוצאות, כתנאים פיזיים של גירוי תאים שונים לגמרי בין דגמים אלה. באופן כללי, כל הדגמים הקיימים להתמקד איך ליישם הטוב ביותר גלי הלם על גבי תאים.
עם זאת, שאלה זו נותרה פתוחה: מה קורה לגלים לאחר שעבר את תרבית התאים? הבעיה העיקרית היא שההבדל של אקוסטיתעכבה של מדיום תרבית תאים ואוויר הסביבה היא כל כך גבוהה, כי יותר מ 99% מגלי הלם מקבלים ביטוי איור 1.
בשל ההבדל בהתנגדות האקוסטית של שתי מדיה הגלים משתקפים לא רק, אלא שלב משמרת של 180 ° מתרחשת כתוצאה מכך כוחות מתיחה חזקים לתאי איור 2.
עכבה אקוסטית מוגדרת כתוצר של הצפיפות של חומר וZ מהירות קול שלה = ρ x ג. למים העכבה אקוסטית היא ZWater = 1,440,000 Ns / 3 מ ', לאוויר זה רק 420 Ns / m 3. ההבדל הגדול בין שני ערכים אלה גורם לשינוי השתקפות ושלב של גלי הלם. פאזה הופכת דופק לחץ חיובי לגל מתיחה.
גם אם כוח מתיחה זו אינו מזיק לתאים, והוא משבש את הרעיון של חיקוי בהשפעות גל הלם vivo במבחנה. בvivo אלהכוחות המתיחה כמעט ולא מתרחשים, בגלל מבנה גוף גדול.
יתר על כן, בחלק האחורי פועל גלים יכול אפילו להפריע הנכנסים אלה. זה עלול לגרום להפרעות. שני סוגים של הפרעה ידועים. התאבכות בונה אומרת ששני הגלים נוספים ובכך וכתוצאה מכך הוכפל המשרעת איור 3. התערבות הרסנית מתרחשת אם גלים לפגוש מנוגדים. זה גורם לביטול של גלים (איור 3). לכן, IVSWT צריך מודל המאפשר לגלי הלם להפיץ לאחר שעבר את תרבית התאים.
אמבט מים IVSWT
שיקולים הבאים החששות שהוזכרו לעיל יובילו אותנו לעיצוב אמבט מים למניעת הבעיות שתוארו איור 4. בעיקרון, זה מורכב מפרספקס בנוי מיכל עם קרום להתחבר לכל סוג של המוליך גל הלם. לצימוד בין הקרום הזה והולכת אולטרסאונד המוליך gel יש להשתמש. אמבט המים מלא במי degassed להימנע cavitation שיתרחש אם הגז היה soluted בתוך המים. דוד בתחתית עם חיישן טמפרטורה המחובר ליחידת בקרה מאפשר לווסת את הטמפרטורה לחיקוי של in vivo תנאים ולהימנע מתרביות תאים להתקרר במהלך ההליך. טמפרטורה יכולה להיות מוחזקת יציבה ב37 מעלות צלזיוס כפי שזה נעשה בחממה. בעל לדגימות התאים מאפשר לטבילה כל סוג של בקבוק תרבות או צינור. ובכך, כלי המדגם צריך להיות מלא לחלוטין עם מדיום התרבות, כמו בועות אוויר יחסמו את גלי הלם! בולם בצורת טריז בקיר האחורי של האמבטיה destructs גלים על מנת שלא לקבל לידי ביטוי ולרוץ בחזרה, כדי למנוע הפרעה.
יתרון נוסף לדגמי IVSWT אחרים הוא האפשרות של שינוי המרחק בין המוליך וצלוחיות התרבות. ממצאים של הקבוצה שלנו ואחרים שמשתמשים במודל זה באופן ברור זהאיך שכל סוג תא מגיב באופן ספציפי מאוד לפרמטרי טיפול שונים. יתר על כן, המגדיר את המרחק בין המקור של הגלים והמדגם הוא קריטי שכן הוא מאפשר לנו לשלוט על התאים להיות במיקום מסוים ביחס למוקד של המוליך גל הלם.
Protocol
Representative Results
Discussion
המשמעות של המודל המוצע לטיפול במבחנה גל הלם היא העובדה שגלים יכולים להפיץ לאחר שעברו את תרבית התאים בניגוד לדגמים קיימים. ובכך, ניתן להימנע מתופעות מטרידות פיזיות כגון כוחות מתיחים. המודל דומה יותר בתנאי vivo מזה על ידי אחרים יישום גלים לצלוחיות תרבית תאים של…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ריינר Schultheiss וולפגנג Schaden להשראה שלהם עבור דגם זה. אנו מודים גם Dorfmüller הנוצרי עבורו את כל המאמצים אדירים הזמן כדי לתמוך במחקר שלנו.
תודה רבות לרוברט Göschl והנס Hohenegger למימוש טכני מדוקדק של הרעיונות שלנו!
Materials
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger – Technical Products | – | |
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipets 25ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | – | |
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| mikrozid disinfectant | Schülke | – | |
| 3,5l degassed water | |||
| paper towels | |||
Riferimenti
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
