Shock Wave application cultures cellulaires
Summary
Les ondes de choc sont aujourd'hui bien connus pour leurs effets régénérateurs. Par conséquent, des expériences in vitro sont d'un intérêt croissant. Nous avons donc développé un modèle in vitro pour les essais d'ondes de choc dans (de IVSWT) qui nous permet de mimer les conditions in vivo, évitant ainsi les effets physiques distrayantes.
Abstract
Les ondes de choc sont aujourd'hui bien connus pour leurs effets régénérateurs. Résultats de la recherche de base ont montré que les ondes de choc ne provoquent un stimulus biologique pour cibler les cellules ou les tissus sans aucun dommage ultérieur. Par conséquent, des expériences in vitro sont d'un intérêt croissant. Différents procédés d'application des ondes de choc sur des cultures de cellules ont été décrites. En général, tous les modèles existants se concentrent sur la façon d'appliquer les meilleures ondes de choc sur les cellules.
Toutefois, cette question reste: Que deviennent les vagues après le passage de la culture cellulaire? La différence de l'impédance acoustique du milieu de culture cellulaire et de l'air ambiant est très élevé, que plus de 99% des ondes de choc se traduit! Nous avons donc développé un modèle qui se compose essentiellement d'un récipient construit en plexiglas qui permet aux ondes de se propager dans l'eau après passage de la culture cellulaire. Cela permet d'éviter les effets de cavitation ainsi que la réflexion des ondes qui seraient autrement perturber ceux à venir. Wie ce modèle, nous sommes en mesure de reproduire les conditions in vivo et ainsi gagner de plus en plus de connaissances sur la façon dont le stimulus physique des ondes de choc se traduit en un signal de cellule biologique ("mécanotransduction").
Introduction
Les ondes de choc sont des ondes de pression acoustique résultant d'une libération soudaine d'énergie, par exemple. que le tonnerre quand la foudre. En médecine ondes de choc ont été utilisés depuis plus de 30 ans de lithotritie pour la désintégration de calculs rénaux. Depuis la découverte fortuite de l'os iliaque épaississement chez les patients lithotritie au début des années 1980, les premières études ont été menées pour évaluer l'effet du traitement par ondes de choc (SWT) sur l'os de guérison 1. Des résultats impressionnants de l'amélioration de la cicatrisation des pseudarthroses des os longs ont pu être observés 2. Par la suite, des indications ont été élargies à des blessures des tissus mous 3. Résultats de la recherche de base ont montré que les ondes de choc ne provoquent un stimulus biologique pour le tissu cible sans dommages ultérieurs. Libération de facteurs de croissance angiogéniques (par exemple, VEGF, PIGF, FGF) est suivie par une angiogenèse significative. Cela a conduit à une nouvelle expansion des indications vers les pathologies ischémiques. Notre groupe et d'autres ont montré l'eff positifect de SWT sur les maladies cardiaques ischémiques chez les modèles animaux, ainsi que dans des essais cliniques 4-6.
Cependant, le mécanisme exact de la manière dont le stimulus physique de SWT est traduit en un signal biologique (mechanotransduction) reste en grande partie inconnue. Comme l'intérêt dans SWT de plusieurs domaines de la médecine augmente continuellement, la quête du mécanisme est de plus en plus intense. Par conséquent, expériences in vitro d'ondes de choc dans gagnent en importance. Outre la réduction de l'expérimentation animale et de la rentabilité, le plus grand avantage de vitro traitement par ondes de choc dans (de IVSWT) peut être la possibilité d'étudier le comportement spécifique d'un certain type de cellule. Dans l'onde de choc régénération tissulaire médiée probablement toutes les cellules du tissu traité sont en cause, même effets systémiques sont discutées. Néanmoins, chaque type de cellule joue un rôle spécifique et possède sa propre fonction intrinsèque. IVSWT nous permet de détecter cette fonction particulière d'une nous donne ainsi une meilleure compréhension des processus sous-jacents complexes.
Les connaissances actuelles sur les effets de l'onde de choc sur les cultures de cellules comprend l'augmentation de la prolifération, de la modification des récepteurs de la membrane cellulaire, l'augmentation et l'accélération de la différenciation cellulaire, la libération de facteurs de croissance et chimio-attractants ainsi qu'une augmentation de la migration cellulaire 9.7.
Effets physiques distrayantes dans la plupart des modèles in vitro diverses méthodes d'application des ondes de choc sur des cultures de cellules ont été décrits. Ce fait conduit au problème qu'il est très difficile de comparer les résultats, que les conditions physiques de la stimulation des cellules sont tout à fait différent entre ces modèles. En général, tous les modèles existants se concentrent sur la façon d'appliquer les meilleures ondes de choc sur les cellules.
Toutefois, cette question reste: Que deviennent les vagues après le passage de la culture cellulaire? Le problème principal est que la différence de l'acoustiqueimpédance du milieu de culture cellulaire et de l'air ambiant est très élevé, que plus de 99% des ondes de choc se traduit Figure 1.
En raison de la différence d'impédance acoustique des deux milieux ne sont pas les ondes reflétées mais seulement un déphasage de 180 ° se produit résultant en des forces de traction solides aux cellules Figure 2.
L'impédance acoustique est définie comme le produit de la densité d'un matériau et sa vitesse de propagation Z = ρ x c. Pour l'eau de l'impédance acoustique est ZWater = 1440000 Ns / m 3, pour l'air, il est à seulement 420 Ns / m 3. La grande différence entre ces deux valeurs donne la réflexion et le déphasage des ondes de choc. Le déphasage devient une impulsion de pression positive en une onde de traction.
Même si cette force de traction n'est pas nocif pour les cellules, elle interfère avec l'idée d'imiter des effets d'ondes de choc vivo et in vitro. In vivo cesforces de traction à peine sont dues à de grandes structures de l'organisme.
En outre, le running back des vagues peut même déranger ceux entrants. Cela peut provoquer des interférences. Deux types d'intervention sont connues. Une interférence constructive que les deux ondes sont ajoutés entraînant ainsi l'amplitude doublé Figure 3. L'interférence destructive se produit si les ondes se rencontrent diamétralement opposée. Il provoque l'abolition des vagues (figure 3). Par conséquent, IVSWT a besoin d'un modèle qui permet aux ondes de choc de se propager après le passage de la culture cellulaire.
bain d'eau IVSWT
Considérations suivantes les préoccupations mentionnées ci-dessus nous conduisent à concevoir un bain d'eau pour éviter les problèmes décrits Figure 4. Fondamentalement, il s'agit d'un plexiglas contenant construit avec une membrane de connecter tout type de applicateur d'ondes de choc. Pour le couplage entre cette membrane et la transmission applicateur ultrasonore gel doit être utilisé. Le bain d'eau est rempli d'eau dégazée pour éviter la cavitation qui pourrait se produire si le gaz a été soluté dans l'eau. Dispositif de chauffage par le bas avec un capteur de température relié à une unité de commande permet de réguler la température de l'imitation de conditions in vivo et pour éviter des cultures de cellules de refroidir pendant la procédure. La température peut être maintenue stable à 37 degrés centigrades comme cela se fait dans un incubateur. Un support pour les échantillons de cellules permet une immersion de n'importe quel type de ballon de culture ou d'un tube. De ce fait, le réservoir d'échantillon doit être complètement remplie de milieu de culture, comme des bulles d'air pourraient bloquer les ondes de choc! Un absorbeur en forme de coin à la paroi arrière de la salle de bain destructs vagues pour ne pas se réfléchie et courir en arrière pour éviter les interférences.
Un autre avantage pour d'autres modèles de IVSWT est la possibilité de faire varier la distance entre l'applicateur et les flacons de culture. Les résultats de notre groupe et d'autres qui utilisent ce modèle s clairementfaçon que chaque type de cellule réagit très spécifiquement à différents paramètres de traitement. De plus, la définition de la distance entre la source des ondes et l'échantillon est cruciale car elle nous permet de contrôler les cellules à se trouver à une position spécifique par rapport à l'orientation de l'applicateur d'onde de choc.
Protocol
Representative Results
Discussion
La signification du modèle proposé pour le traitement in vitro de l'onde de choc dans le fait que les ondes peuvent se propager après le passage de la culture cellulaire, contrairement à des modèles existants. Ainsi, les effets physiques inquiétants tels que les forces de traction peuvent être évités. Le modèle ressemble plus étroitement les conditions in vivo que celle de l'application d'autres vagues de leurs flacons de culture cellulaire directement.
<p c…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Reiner Schultheiss et Wolfgang Schaden pour leur inspiration pour ce modèle. Nous remercions également Christian Dorfmüller pour ses tous temps des efforts considérables pour soutenir notre recherche.
Un grand merci à Robert Göschl et Hans Hohenegger pour la réalisation technique rigoureuse de nos idées!
Materials
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger – Technical Products | – | |
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipets 25ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | – | |
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| mikrozid disinfectant | Schülke | – | |
| 3,5l degassed water | |||
| paper towels | |||
Riferimenti
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