Bedöma Förändringar i Volatile narkos Känslighet av möss efter lokal eller systemisk farmakologisk intervention

Summary

Förlust av den rätande reflex har länge fungerat som en vanlig beteende surrogat för medvetslöshet, även kallad hypnos, i försöksdjur. Förändringar i flyktiga narkos känslighet som orsakats av farmakologisk intervention kan upptäckas med ett noga kontrollerat system med hög genomströmning bedömning, som kan anpassas för leverans av alla inhalerade terapeutiskt.

Abstract

En önskvärd endpoint av narkos är det tillstånd av medvetslöshet, även känd som hypnos. Definiera det hypnotiska tillståndet hos djur är mindre rättfram än det är hos människor. En allmänt använd beteende surrogat för hypnos hos gnagare är förlusten av upprätningsreflex (LORR), eller den punkt där djuret inte längre svarar på deras medfödda instinkt att undvika sårbarhet rygg VILA. Vi har utvecklat ett system för bedömning LORR i 24 möss samtidigt medan noga kontrollerar för eventuella blandar ihop, bland annat temperatursvängningar och varierande gasflöden. Dessa kammare medger tillförlitlig bedömning av narkoskänslighet mätt med latens för att återvända för den rätande reflex (RORR) efter en fast narkos exponering. Alternativt, med hjälp av steg ökar (eller minskar) i bedövningsmedel koncentration, kamrarna möjliggör även bestämning av en befolkning känslighet för induktion (eller uppkomst) mätt med_EC50 och Hill lutning. Slutligen kan de kontrollerade miljökammare som beskrivs här anpassas för en mängd olika alternativa användningar, bl.a. inhalerad leverans av andra droger, toxikologiska studier, och även realtidsövervakning av vitala funktioner.

Introduction

Narkosmedel definieras av sin förmåga att orsaka ett reversibelt tillstånd av hypnos i en mängd olika arter, men en förklaring till hur en sådan skiftande klass av läkemedel allt kan framkalla en sällsam endpoint fortfarande instabil. Ett antal teorier har belägen under åren, med början i Meyer-Overton korrelation mellan narkos potens och fettlöslighet, vilket föreslås allmänna membranstörningar som grund för hypnos ^1,2. Nyare uppgifter tyder på att protein mål som påverkar neuronal signalering bidrar till bedövande effekt. Möss har visat sig vara en oumbärlig modell för att utforska dessa teorier på grund av homologin mellan mus och människa narkos lyhördhet. Även om en mus som inte kan tillfrågas om sin subjektiva medvetande under narkos, vissa primitiva reflexer fungerar som användbara surrogatmått gnagare hypnos. Under de första dagarna efter födseln, möss utvecklar en reflexiv rätande response som hindrar dem från att passivt placeras i ryggläge ^3. Dosen av anestesi där en mus förlorar sin rätande reflex korrelerar väl med mänskliga hypnotiska doser ^4.

Bedömning av förlust av upprätningsreflex (LORR) har blivit ett vanligt laboratoriestandard för att testa narkos känslighet hos möss, samt en mängd andra arter, inklusive råtta, marsvin, kanin, iller, får och hund ^5-8. Dosen av en viss bedövningsmedel där LORR kommer att ske för medlemmar av en art är extremt konsekvent, men det kan förskjutas avsevärt av miljöfaktorer. Till exempel, sömnbrist råttor är känsligare för både flyktiga och intravenösa bedövningsmedel ⁹ och råttor med hög aerob kapacitet är mindre känsliga för isofluran ^10. Hypotermi har också visat sig minska dosen av många anestetika krävs för hypnos i ett stort spektrum av arter ^11-14. Föratt tillförlitligt identifiera bedövnings dos vid vilken LORR sker i en grupp försöksdjur, är det viktigt att bedömningen miljön följas noga för att minimera stress, behålla euthermia, och leverera lika mycket läkemedel till alla ämnen. Föga förvånande är genetiska faktorer också kända för att förändra narkos känslighet ^15-18. Följaktligen bör noggrant övervägande också ägnas kontrollen för genetisk bakgrund ^19.

Vi har utvecklat en anordning som säkerställer identiska gasformigt bedövningsmedel levereras till var och en av 24 möss under upprätthållande av en konstant 37 ^° C omgivning. Den transparenta cylindriska utformningen av våra exponeringskammare möjliggör snabb LORR bedömning och enkel integration av telemetriska fysiologiska mätningar. Detta system har visat att noggrant mäta isofluran, halotan och sevofluran induktion _EC50 och tid till uppkomst i vildtyp möss ^20. Vi har även använtdetta system för att observera förändringar i narkoskänslighet i möss med genetiska mutationer och riktade hypotalamus lesioner ^21-23. Här beskriver vi två sätt på vilka narkos känslighet kan bedömas efter en farmakologisk intervention med hjälp av vår kontrollerad miljö apparat. Steady-state fenotypning av flyktiga narkosinduktion och uppkomst känslighet kräver 8-10 timmar och är därmed bäst anpassade för studier där försöksbetingelserna inte förändras, till exempel vid kroniska eller långverkande farmakologiska interventioner. Men för kortverkande behandlingar vars effekter skingra kraftigt över tiden vi också presentera en enkel procedur för att utvärdera förändringar i upprätningsreflex följande stereotaktiskt-riktade microinjections eller intravenösa läkemedelsbehandlingar som väsentligt påverkar narkos uppkomst. Dessa tester utgör en liten delmängd av de potentiella tillämpningar för denna kontrollerad miljö-systemet, som skulle kunna anpassas för valfritt antal subjjekt av olika arter för att få någon typ av inhalerade terapeutiska.

Protocol

Alla som deltar i djurförsök som beskrivs häri har godkänts av University of Pennsylvanias Institutional Animal Care och användning kommittén. 1. Översikt av testapparater Testapparaten består av 24 tydliga akryl cylindriska kammare 10 cm lång och 5 cm i diameter (total volym av 200 ml). Denna storlek är lämplig för en typisk 25 g vuxen mus. Chambers har portar vid varje ände för gas-inlopp och utlopp. Utloppsänden är borttagbar, så att djur lätt kan lastas in i …

Representative Results

Figur 1 visar användbarheten av stegvis LORR-analys för att fastställa långsiktiga effekter av farmakologisk intervention. Ibotensyra (IBA) är en agonist av glutamaterg N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorn, som ofta används som ett excitotoxin att orsaka permanenta neuronala lesioner. Här vi injicerade 10 nl av 1% IBA bilateralt i ventrolaterala preoptiska området (VLPO) i C57BL/6J-möss en vecka före testning. Majoriteten av nervceller i denna kärna uppvisar låga bränning under vakenhet och …

Discussion

Även om bedömningen av LORR i en enda mus är en till synes enkel uppgift, är det ändå viktigt att bibehålla identiska fysiologiska förhållanden mellan individer i syfte att samla in tillförlitliga uppgifter från en grupp djur. Den hårt reglerad, hög kapacitet apparat LORR presenteras här erbjuder ett sätt att standardisera experiment och maximera effektiviteten. Genom att följa de grundläggande principerna för värmereglering och lika flödesfördelning, kan systemet lätt återskapas och anpassas för…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments
Oxygen	Airgas	OX300
Isoflurane	Butler Schein		Any volatile anesthetic of interest may be substituted
Name of Material	Company	Catalogue Number	Comments
Mass flow meter- 10 SLPM	Omega Engineering	FMA-A2309
Mass flow meter- 500 SCCM	Omega Engineering	FMA-A2305
Anesthetic agent analyzer/gas indicator	AM Bickford	FI-21 Riken
Heating water pump	Fisher Scientific	13-874-175
Temperature transponders	BMDS	IPTT-300
RF temperature reader	BMDS	DAS-6007