En metode til at forberede solid-state nanopores i opløsning for biomolekylære translokation eksperimenter præsenteres. Ved at anvende korte pulser med høje elektriske felter kan nanopore diameter være kontrollerbart udvidet med subnanometer præcision og dens elektriske støjegenskaber væsentligt forbedret. Denne procedure udføres in situ ved anvendelse af standard laboratorieudstyr under eksperimentelle betingelser.
Solid-state nanopores er dukket op som et alsidigt værktøj til karakterisering af enkelte biomolekyler, såsom nukleinsyrer og proteiner 1. Men oprettelsen af en nanopore i en tynd isolerende membran er stadig en udfordring. Fabrikation metoder involverer specialiserede fokuseret elektronstråle systemer kan producere veldefinerede nanopores, men udbyttet af pålidelige og støjsvage nanopores i kommercielt tilgængelige membraner fortsat lav 2,3 og størrelse kontrol er nontrivial 4,5. Her anvendelse af høje elektriske felter til at finjustere størrelsen af nanopore samtidig sikre en optimal støjsvag ydeevne er dokumenteret. Disse korte pulser af høj elektrisk felt anvendes til at fremstille en uberørt elektrisk signal og muliggøre udvidelse af nanopores med subnanometer præcision ved længere tids eksponering. Denne fremgangsmåde udføres in situ i et vandigt miljø ved anvendelse af standard laboratorieudstyr, forbedre udbyttet og reproducerbarhed solid-state nanopore opspind.
Biologisk og solid-state nanopores er et middel til sensing biomolekylære analytter på enkelt molekyle niveau 1. Individuelle nanopores er typisk indlejret i tynde isolerende membraner, der giver den eneste kanal for ionstrømmen at passere mellem to flydende reservoirer. Udnytte principperne i større skala Coulter tællere, nanopore eksperimenter vedrører ændringer i ionstrømmen at bestemme længden, størrelse, ladning og kropsbygning af ladede biomolekyler som de elektroforetisk drives gennem en nanopore i tilstedeværelse af en ekstern elektrisk felt.
Mens biologiske nanopores såsom α-hemolysin typisk tilbyde større følsomhed og støjsvage egenskaber 3, den støtte tolagede er skrøbelig og fast størrelse, hvilket begrænser deres anvendelighed. Solid-state nanopores på den anden side er fremstillet i tynd (10-50 nm) siliciumnitrid eller siliciumoxid membraner og kan være fremstillet af forskellige Sizes, let integreres med wafer-skala teknologier 6,7, og er mere robuste, giver mulighed for en bredere vifte af eksperimentelle betingelser. På trods af disse fordele, solid-state nanopore teknologier lider flere praktiske ulemper, der begrænser deres anvendelighed til biomolekylære studier. Mens kontrol af nanopore størrelse er mulig, er det typisk dyrt og besværligt at opnå, kræver specialiseret udstyr og uddannet personale. For eksempel har nanopores boret ved fokuseret-ionstråle nylig blevet vist at krympe under specifikke eksperimentelle betingelser i en scanning elektron mikroskop (SEM) 5. I andre fremgangsmåder kan nanopores boret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) udvide eller indsnævre efter beam betingelser og efterfølgende udsættelse for vandige opløsningsmidler 8. I disse tilfælde den opnåelige række nanopore størrelser er begrænset, vanskelig at kontrollere og endda upålidelige som størrelsen af nanopore kan ændre sig efter kemisk behandling ellernår nedsænket i en bestemt væske miljø 9.
Den ioniske strøm gennem solid-state nanopores kan også lider af forhøjet støj, kilderne som er et intenst undersøgt emne i nanopore litteratur 2,3,10,11. Selv om der er foreslået forskellige metoder til at reducere elektrisk støj, udbyttet af pålidelige, stabile støjsvage nanopores er typisk lavt. Deposition af kulstofholdige aflejringer under boring og billedbehandling kan have skadelige virkninger på det elektriske signal kvalitet, hvilket ofte gør fuldstændig befugtning en udfordring og forårsager dannelse af nanobubbles, der kan være svære at fjerne 12. Endvidere tilstopning af nanopore af analytmolekyler forringer signalkvaliteten rendering porer ubrugelig til yderligere forsøg 13,14. Tilsammen disse effekter i høj grad reducere udbyttet af funktionelle nanopore enheder og øge omkostningerne forbundet med solid-state nanopore forskning.
Anvendelsention af en spænding med Ag / AgCl elektroder til at producere høje elektriske felter i intervallet 0,15-0,3 V / nm præsenterer en overraskende enkel løsning på disse udfordringer. Gennem cykliske anvendelse af korte spændingsimpulser, en ren, støjsvag nanopore overflade ideel til enkelt-molekyle studier er produceret. Langvarig udsættelse for høje elektriske felter initierer fjernelse af membranmaterialet udgør pore væg, hvilket resulterer i en stigning i nanopore diameter. Denne vækst kan styres præcist ved tuning pulsen styrke og varighed. Da de nuværende spor nedbrydes i løbet af et eksperiment på grund af tilstopning af nanopore som molekyler adsorberes til nanopore overflade, kan denne proces gentages for at genvinde tilstoppede enheder, der ellers ville være blevet kasseret. Som sådan er udbyttet af funktionelle nanoporer yderligere af evnen til at anvende den samme enhed flere gange. Denne metode giver flere fordele, da det er hurtigt udført i væske under eksperimentelbetingelser, kræver kun standard laboratorieudstyr, kan automatiseres med software og frembringer funktionelle høj kvalitet nanopores med et udbytte på over 95%.
Kontrol af nanopore størrelse er af fundamental betydning i biomolekylære sensing applikationer. Nanopore diametre skal være på rækkefølgen af størrelsen af de molekyler, som testes, og de skal være stor nok til at rumme prøven, men lille nok til at opnå optimal signal-til-støj. Mens kontrol af størrelse ved hjælp af den metode, der præsenteres af at anvende høje elektriske felter er ensrettet i at nanopore diametre kun steget i hele processen, kan nanopores med diametre mellem 3-100 nm være gammeldags, med subnanometer præcision. Som 3-4 nm porer kan let fremstillet ved hjælp af en TEM 23. Dette giver mulighed for pålidelig produktion af solid-state nanopores til en bred vifte af applikationer fra sondering ssDNA struktur til interaktionen af voluminøse protein-ligand-komplekser. Mens nanopore vækst over 100 nm kan være meget hurtige og mindre præcise, mere moderate forstørrelse betingelser være ansat for at opnå bedre kontrol over processen. Som sUCH, det vigtigste skridt for at opnå en effektiv størrelse kontrol er valget af puls styrke og varighed for at afbalancere Forstørrelse effektivitet og præcision der kræves for at opnå en ønsket porediameter. Dette er yderligere fremhævet af udvidelsen af tyndere nanopores (10 nm tykkelse), hvor udvidelsen er observeret en lavere skævhed, men sammenlignelig elektrisk feltstyrke. Afhængig af den endelige størrelse, er det generelt muligt at forstørre en nanopore til sub-100-nm diametre i et par minutter.
Tilsvarende udelukker store lavfrekvente løbende udsving enkelt-molekyle studier, som det er næsten umuligt at skelne translokation signaler fra baggrundsstøj. Ufuldstændig befugtning 24, kan tilstedeværelsen af kulstofholdige rester tilbage efter indledende fabrikation 25 og adsorption af snavs på nanopore væg 13 forringe signalkvaliteten, som kræver ekstra rengøring med skrappe kemiske behandlinger, der ofte er inefficacious. Interessant, det er fælles for solid-state nanopore protokoller til at understrege vigtigheden af at rense nanopore i Piranha-opløsning eller med ilt plasma før montering at hjælpe befugtning eller fjerne enhver forurening tilovers fra boring, billedbehandling og håndteringsprocesser. Selv med denne behandling dog nanopores ofte ikke våd eller fortsætte med at udvise høj støj, og den foreslåede løsning for mislykkede forsøg er at udføre ekstra rengøring, der kan være ekstremt tidskrævende 14. Med anvendelsen af høje elektriske felter, kan disse lange protokoller ikke være nødvendigt afhængigt af programmet. Det blev fundet, at de fleste udstyr kan repareres in situ ved anvendelse af den heri beskrevne fremgangsmåde, således sparer tid og dermed behovet for at behandle barske kemikalier. De vigtigste skridt i at afbøde elektrisk støj er en simpel stigning i spænding og / eller puls varighed til helt våd pore og fjerne løst bundne rester.Nanopores behandlet på denne måde pålideligt anvendes i biomolekylære translokation eksperimenter, såsom passage af DNA og proteiner. Hvis disse molekyler klæbe til pore væggen fører til en tilstoppet og støjende elektrisk signal kan høje elektrisk felt pulser genanvendes til at fjerne forhindringen og genvinde støjsvage egenskaber for yderligere eksperimenteren uden afmontering af nanopore chip fra fluidumydelse celle.
Anvendelsen af høje elektriske felter ved hjælp af opsætningen, som beskrives, er begrænset af kravet om en ekstern strømforsyning, der kan anvende op til 10 V og strøm forstærker, som mangler følsomhed og støjsvage egenskaber ved høj båndbredde (> 1 kHz) for enkelt molekyle sensing. Mens typiske biomolekylære eksperimenter afhængige af en støjsvag nuværende forstærker, der er begrænset til ± 1 V, er det ligetil at designe et enkelt system, der kunne udrette både høj elektrisk felt condition og følsom aktuel måling med en adjustabil gevinst. På trods af denne begrænsning, overgangen fra en opsætning til den anden er hurtig og ligetil. I sammenligning med de eksisterende teknikker til kontrol af nanopore størrelse såsom brugen af SEM 5, termisk oxidation og membran omforme 8 høje elektriske felter giver en hurtigere, mere præcis og billigere metode, der kan udføres på laboratoriet bænken ved hjælp af standard-udstyr og give en bredere vifte af nanopore størrelser. Evnen til hurtigt og reproducerbart reducere lavfrekvent støj gør også indledende fabrikation mere pålidelig og forlænger levetiden af solid-state nanopores, som tidligere anvendte porer kan forynges til yderligere forsøg. Alt i alt over 95% af nanopores af varierende tykkelser aircondition med høje elektriske felter udstillet meget lidt lavfrekvent støj karakteristik, hvilket gør dem egnede til biomolekyler sensing. Fabrication er således lettere og mere pålidelig, hvilket gør solid-state nanopore eksperimenter mere tilgængeligt til forskere og potentielt giver mulighed for en vej mod kommercialisering af nanopore teknologier gennem mere robuste fremstillingsprocesser.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender støtte fra naturvidenskab og teknik Research Council of Canada, Canada Foundation for Innovation og Ontario Research Fund. Vi takker Y. Liu om støtte i nanopore fremstilling og karakterisering, L. Andrzejewski for værdifulde diskussioner og teknisk support, og A. MARZIALI hjælp til nanopore software og instrumentering design.
JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells – handle with caution |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution – handle with caution |
Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution – handle with caution |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
Hot plate | VWR | Heating piranha solution |