Exemple de correction de la dérive Après 4D confocale imagerie time-lapse
Summary
Microscopie time-lapse permet la visualisation des processus de développement. La croissance ou la dérive d'échantillons lors de l'acquisition d'image réduit la capacité de suivre et de mesurer les mouvements de cellules au cours du développement de précision. Nous décrivons l'utilisation de logiciels open source de traitement d'image pour corriger la dérive en trois dimensions de l'échantillon au cours du temps.
Abstract
La génération de quatre dimensions (4D) ensembles de données confocale; constitué de séquences d'images 3D au fil du temps; fournit une excellente méthode pour capturer les comportements cellulaires impliqués dans les processus de développement. La capacité de suivre et de suivre les mouvements cellulaires est limitée par les mouvements échantillons qui se produisent en raison de la dérive de l'échantillon ou, dans certains cas, la croissance lors de l'acquisition de l'image. Cellules de suivi dans des ensembles de données touchées par la dérive et / ou la croissance sera d'intégrer ces mouvements dans toute analyse de la position de la cellule. Cela peut entraîner le mouvement apparent de structures statiques au sein de l'échantillon. Donc avant de suivi de la cellule, toute dérive de l'échantillon doit être corrigée. Utilisation de l'open source Fidji répartition 1 de 2,3 ImageJ et les outils de LOCI incorporés 4, nous avons développé la 3D correcte dérive plug-in pour supprimer le mouvement de l'échantillon erroné dans les ensembles de données confocale. Ce protocole compense efficacement traduction de l'échantillon ou des modifications de po focaltion en utilisant la corrélation de phase d'enregistrer chaque point de temps d'un à quatre dimensions des ensembles de données confocale tout en conservant la possibilité de visualiser et mesurer les mouvements cellulaires sur de longues expériences time-lapse.
Introduction
L'imagerie confocale est largement utilisé en biologie cellulaire et du développement de suivre les mouvements et les changements de cellules de morphologie. Capture d'une série de sections optiques à différents plans focaux permet la génération d'un modèle en trois dimensions (3D) d'un échantillon, qui peut ensuite être étendue à quatre dimensions (4D) en créant une série time-lapse d'ensembles de données 3D. La génération d'ensembles de données 4D permet la mesure détaillée des mouvements et des comportements cellulaires. Dans les expériences time-lapse à long terme, il est fréquent d'observer le mouvement de l'échantillon. Cela peut être causé par de légères imprécisions dans la phase de contrôle de matériel et positions focales. Alors que dans les autres cas, la dérive est une suite de mouvements provoqués par la croissance de l'échantillon ou de la flexibilité dans le support de montage de l'échantillon. Il existe des méthodes pour compenser ou de limiter ces mouvements, y compris des améliorations aux systèmes de focalisation de matériel et une rigidité accrue du milieu de montage. Cependant, ces approches ne peuvent pas être appliqués dans de nombreux cas en raison de la formation d'image set jusqu'à tenu de fournir des conditions adéquates pour le maintien des échantillons et de la croissance. Solutions logicielles open source existent pour la correction de mouvement en 2D au fil du temps, grâce à l'utilisation des StackReg et TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 plugins dans ImageJ ou Fidji, mais ceux-ci ne peuvent pas être appliquée à des ensembles de données 4D.
Pour corriger la dérive de l'échantillon, nous avons développé un plug-in (dérive Corriger 3D) d'utiliser la plate-forme open-source de traitement de l'imagerie, Fidji 1. Notre plug-in est capable d'effectuer l'enregistrement de corrélation de phase pour corriger le mouvement qui se produit en raison de la dérive de l'échantillon en trois dimensions expériences time-lapse. Corrélation de phase 6 est une méthode efficace de calcul pour déterminer la traduction entre les images. Le plug-in décrit ici utilise la bibliothèque de corrélation de phase développé par Preibisch et al. 7. Dans des expériences multi-canal, le plug-in utilise un canal de déterminationne la correction nécessaire. Cette correction est ensuite appliquée à tous les canaux supplémentaires résultant de l'enregistrement de l'ensemble de données 4D.
Dans le système de modèle de poisson-zèbre, il est possible de procéder à l'imagerie time-lapse sur une période de plusieurs heures, voire plusieurs jours 8. Une méthode commune pour le montage du poisson zèbre est d'intégrer l'embryon vivant anesthésié en agarose à bas point de fusion (0,8-1,5%), de limiter son mouvement 9-11. La croissance de l'échantillon tandis que le mouvement est restreint se produit encore, ce qui entraîne dans les cellules à l'intérieur du champ de vue de la position de décalage. Afin de suivre le déplacement des cellules à l'intérieur de l'embryon, il est nécessaire d'abord pour corriger le mouvement de l'ensemble de l'échantillon. Ce protocole a été élaboré avec des échantillons de poisson zèbre, et a été utilisée pour le développement d'image de somites 12 mais peut être appliquée à n'importe quel ensemble de données 4D confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre capacité à utiliser un logiciel de post-traitement pour corriger la dérive échantillon d'ensembles de données provenant de longues expériences de microscopie time-lapse est limitée par un certain nombre de facteurs. La capacité de discerner la dérive par rapport à un mouvement migratoire d'un échantillon dépend des marqueurs cellulaires utilisés. Les marqueurs cellulaires qui sont soit largement exprimés dans un échantillon ou ne sont pas impliqués dans les événements migrateurs lors de l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Gaby Martins et les organisateurs de l'atelier EMBO2010 3D Imaging développement où ce travail a commencé et tous les contributeurs aux projets Fidji et ImageJ.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
Riferimenti
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