Prov Korrigering Drift Efter 4D Confocal Time-lapse avbildning

Summary

Time-lapse mikroskopi möjliggör visualisering av utvecklingsprocesser. Tillväxt eller avdrift av prover under bilden förvärvet minskar förmågan att noggrant följa och mäta cellrörelser under utvecklingen. Vi beskriver användningen av öppen källkod bildbehandlingsprogram för att korrigera för tredimensionell prov glida över tiden.

Abstract

Alstringen av fyrdimensionell (4D) konfokala datamängder; bestående av 3D-bildsekvenser över tiden; ger en utmärkt metod för att fånga cellulära beteenden involverade i utvecklingsprocesser. Möjligheten att spåra och följa cellrörelser begränsas av prov rörelser som uppstår på grund av att glida av provet eller, i vissa fall, tillväxt under bildtagning. Spårnings celler i datamängder som drabbats av drift och / eller tillväxt kommer att införliva dessa rörelser i någon analys av cellposition. Detta kan resultera i den skenbara rörligheten av statiska strukturer inom provet. Därför före spårning cell bör alla prov drift korrigeras. Med hjälp av öppen källkod Fiji fördelning ¹ av ImageJ ^2,3 och de ingående loci verktygen ^4, vi utvecklat Rätt 3D drift plug-in för att ta bort felaktiga provrörelse i konfokala datamängder. Detta protokoll effektivt kompenserar för provöversättning eller förändringar i fokus ponings genom utnyttjande fas korrelation för att registrera varje tidpunkt av en fyra-dimension konfokala datauppsättningar under bibehållande av förmågan att visualisera och mäta cellrörelser över utsträckta tidsförlopp experiment.

Introduction

Confocal avbildning används ofta i cell-och utvecklingsbiologi för att följa cellrörelser och förändringar i morfologi. Fånga en serie optiska sektioner vid olika fokalplan tillåter alstring av en tredimensionell (3D) modell av ett prov, som sedan kan förlängas i fyra dimensioner (4D) genom att skapa en tidsförlopp serie 3D-datamängder. Den generation av 4D dataset möjliggör detaljerad mätning av cellrörelser och beteenden. I långtidstidsförlopp experiment är det vanligt att observera provrörelse. Detta kan orsakas av mindre fel i hårdvaran kontrollerar scenen och fokala positioner. Även i andra fall, är drift till följd av rörelser som induceras av prov tillväxt eller flexibilitet i provet montering media. Metoder finns för att kompensera eller begränsa dessa rörelser däribland förbättringar av hårdvara med fokus system och ökad styvhet i monteringsmedel. Dock kan dessa metoder inte tillämpas i många fall på grund av bild set upp krävs för att ge goda förutsättningar för att prover underhåll och tillväxt. Öppen källkod-lösningar existerar för korrigering av rörelsen i 2D med tiden, med hjälp av de StackReg och TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ⁵ plugins i ImageJ eller Fiji, men dessa kan inte tillämpas på 4D-datamängder.

För att korrigera för provet drift har vi utvecklat en plug-in (Rätt 3D-drift) för att utnyttja öppen källkod imaging-bearbetning plattform, Fiji ^1. Vår plug-in kan utföra faskorrelation registreringen att korrigera rörelser som uppstår till följd av provglidning tredimensionella tidsförlopp experiment. Fas korrelation ⁶ är ett beräkningseffektiv metod för att bestämma översättningen mellan bilderna. Plugin-programmet som beskrivs här utnyttjar fas-korrelationsbiblioteket utvecklats av Preibisch et al. ^7. I flerkanaliga experiment utnyttjar Stick en kanal för att bestämne den korrigering som krävs. Denna korrigering tillämpas sedan på ytterligare kanaler som leder till registrering av 4D dataset.

I zebrafisk modellsystem är det möjligt att utföra tidsförlopp avbildning under en period av flera timmar eller till och med flera dagar ^8. En vanlig metod för montering av den zebrafisk är att bädda in den bedövades levande embryo i lågsmältande agaros (0,8 till 1,5%), som begränsar dess rörelse ^9-11. Även om rörelsen är begränsad tillväxt av provet fortfarande sker, vilket resulterar i de celler inom synfältet skiftande position. För att följa rörelsen av cellerna inuti embryot är det nödvändigt att först korrigera för förflyttning av hela provet. Detta protokoll har utvecklats med zebrafisk exemplar, och har använts för att bild somit utveckling ¹² men kan tillämpas på alla 4D konfokal dataset.

Protocol

1. 4D Time-lapse avbildning Experiment De inställningar som används för bildtagning kommer att variera beroende på vilken utrustning som används. Förmågan av konfokalmikroskopi att optiskt sektionen ett prov beror på ett antal faktorer: våglängden för excitation, pinhole storlek, numerisk apertur av målet, brytningsindex av provet och det medium i vilket provet är inbäddad. Storleken på den konfokala hål vald kommer att bestämma tjockleken av det optiska avsnittet uppsamlades….

Representative Results

I utvecklingszebrafisk, snabba muskelcellerna smälter in i flerkärniga fibrer från 19 timmar efter befruktning (20 – somit scenen) 13. I syfte att åskådliggöra rörelsen hos kärnor och fusion av muskelceller vi utförts 4D konfokalt tidsförlopp avbildning med användning av en transgen stam som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av skelett α-aktin promotor för att märka alla av muskel celler 14 och injiceras RNA som kodar för det röda fluorescerande proteinet …

Discussion

Vår förmåga att använda efterbearbetning programvara för att rätta prov drift av datamängder som härrör från längre tidsförlopp mikroskopi experiment begränsas av ett antal faktorer. Förmågan att urskilja drift kontra migrations av ett prov är beroende av de cellulära markörer som används. Cellulära markörer som antingen är allmänt uttryckta i ett prov eller inte inblandade i flytt händelser under bildtagning ger den bästa källan för driftkorrigering. Insticksprogrammet använder en enda kanal…

Materials

Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Low gelling temperature agarose	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Dumont #4 Forceps	Electron Microscopy Sciences	0208-4-PO
Disposable 3mL graduated	Samco	212
Polyethylene transfer pipette
9cm bacterial grade Petri dishes	Greiner Bio One	632180
Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing	Bola	S1815-04
Zeiss LSM-710 Confocal microscope	Zeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective	Zeiss	421452-9600-000