Détection du génome et des transcriptions d'un virus à ADN persistant dans neuronaux tissus par fluorescence In situ L'hybridation combinée avec immunocoloration

Summary

Nous avons établi un protocole fluorescent in situ d'hybridation pour la détection dans un génome de virus de la persistance de l'ADN dans des coupes de tissus de modèles animaux. Ce protocole permet l'étude de processus de l'infection par co-détection du génome viral, de ses produits d'ARN, et les protéines virales ou cellulaires à l'intérieur des cellules individuelles.

Abstract

Cellule à l'unité co-détection d'un gène, le produit de l'ARN et des protéines régulatrices cellulaires est critique pour étudier la régulation de l'expression génique. Il s'agit d'un défi dans le domaine de la virologie, en particulier pour les virus à ADN persistants nucléaires répliquant qui impliquent des modèles animaux pour leur étude. Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) établit une infection latente permanente dans les neurones périphériques. Virus latent sert de réservoir, d'où il réactive et induit un nouvel épisode herpétique. La biologie de la cellule de HSV-1 de latence reste mal compris, en partie en raison de l'absence de méthodes pour détecter les génomes de HSV-1 in situ dans des modèles animaux. Nous décrivons un ADN hybridation fluorescente in situ (FISH) dans l'approche détecter efficacement faible nombre de copies de génomes viraux dans des coupes de tissus neuronaux de modèles animaux infectés. La méthode repose sur démasquage antigénique à base de chaleur, et des sondes d'ADN directement marqués maison, ou des sondes disponibles dans le commerce. Nous avons développé un stai tripleapproche ning, combinant l'ADN à l'ARN FISH-FISH et immunofluorescence, en utilisant la peroxydase en fonction d'amplification du signal pour accueillir chaque exigence de coloration. Une amélioration majeure est la possibilité d'obtenir, dans les 10 sections um de tissu, les signaux basse fond qui peuvent être imagés à haute résolution par microscopie confocale et à grand champ épifluorescence classique. De plus, la coloration triple a travaillé avec une vaste gamme d'anticorps dirigés contre les protéines cellulaires et virales. Le protocole complet 2,5 jours pour accueillir anticorps et la pénétration de la sonde dans le tissu.

Introduction

Type de virus de l'herpès simplex 1 (HSV-1) est un virus persistant neurotrope humain, l'établissement d'une infection latente à long terme dans les neurones du ganglion de Gasser (TG) du système nerveux périphérique, à partir de laquelle il réactive périodiquement de se répliquer et se propager. Le génome de HSV-1 est un ADN double brin de 150 kb localisation dans le noyau du neurone de l'hôte où il reste des plasmides multicopies comme chromatinized, qui ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule hôte ^1,2. Au cours de la latence, le programme génétique de HSV-1 cycle réplicatif est fortement réprimée, et l'expression des gènes est limitée à la transcription associé à la latence (LAT) locus, à partir de l'établissement de la latence initiation de réactivation ^3. LAT produit une longue 8,5 kb non codantes de l'ARN transformé en un 2 ko lasso majeur stable, et plusieurs miARN ^4-7. HSV-1 de latence se caractérise donc par la présence de l'ADN viral génomique, ARN LAT, et l'absence de protéines du cycle de replication détectables.

ontenu "> modèles animaux, principalement la souris et le lapin, sont des modèles expérimentaux récapitulant quelques éléments sur la latence chez l'homme. L'un des principaux intérêts de ces modèles est qu'ils permettent d'étudier les aspects physiologiques de HSV-1 de latence dans les sujets immunocompétents. cours des dernières décennies , de nombreux outils expérimentaux, tels que des virus et des souris génétiquement modifiées, ont été développées pour étudier la physiologie, de la génétique et de la biologie cellulaire de HSV-1 de latence, à partir de tissus animaux. Jusqu'à présent, l'ADN génomique viral a été détecté et quantifié par transfert de Southern et qPCR de dissocier les TG. Toutefois, il n'existe actuellement aucune méthode pour détecter le HSV-1 génomique par hybridation in situ sur des coupes de tissu ^8. En conséquence, la latence est couramment évaluée sur des coupes histologiques par la détection de l'ARN LAT par hybridation d'ARN in situ, plutôt que la détection du génome viral. Comme il a été impossible de caractériser les cellules infectées en fonction de la présence de génomes viraux, this limitation technique a été un inconvénient majeur pour l'analyse de nombreux aspects des interactions hôte-virus, tels que la relation entre le génome viral et l'expression cellulaire et virale ou gène de l'hôte à médiation cellulaire réponse immunitaire ^9,10.

Plus important encore, l'hétérogénéité de l'infection latente de cellule à cellule reste relativement inexploré et a été montré pour être un élément clé de la latence chez la souris et dans les neurones ganglionnaires sensorielles humaines implantées dans des souris SCID ^11-17. En règle générale, il a été montré par qPCR que le génome de HSV-1 du nombre de copies par cellule varie de 5 à plusieurs centaines. Bien que LAT apparaît comme un régulateur clé de la latence et la réactivation, les données qPCR sur les neurones isolés et en PCR in situ ont indiqué que seul un sous-ensemble de neurones infectés de manière latente, aussi bas que 30%, exprime le locus LAT ^11,12,18-21. Comment la cellule hôte et l'environnement cellulaire à l'intérieur de l'impact de la mise en place sur le tissu de la latence du virus etexpression des gènes viraux reste incertaine. Nous décrivons ici un solide hybridation fluorescente in situ (FISH) de la méthode pour la détection efficace de la copie de faible HSV-1 de l'ADN génomique à l'intérieur des sections de tissus neuronaux animales dans. Cette méthode a été conçue et utilisée par nous pour obtenir l'accès à haut microscopie imagerie de résolution qui est nécessaire pour étudier l'interaction du génome viral avec les cellules de l'hôte composants intra-nucléaires ^22. En outre, nous décrivons un procédé de coloration multiple pour la détection simultanée de l'ADN viral à ARN et des protéines, qui est un outil unique pour décrire les interactions virus-hôte qui régulent l'expression des gènes viraux. La méthode peut également être appliquée à un large éventail d'analyses nécessitant la détection de HSV-1 génome latent, comme la quantification des neurones infectés dans grand nombre de sections. Une étape clé est d'appliquer un traitement de récupération de l'antigène de faire l'ADN viral accessible à l'hybridation. Ainsi, ce protocole pourrait également être efficace pour la détectiond'autres virus ADN double brin, qui ne sont actuellement pas détectable par des approches ADN-FISH conventionnels dans les tissus animaux.

Protocol

Cette méthode a été utilisée dans une étude publiée précédemment 22. Pour le fond général et la description de la manipulation classique sur ISH, IF et FISH, nous suggérons la littérature disponible après 23. Une. Infection des animaux Toutes les procédures impliquant des animaux expérimentaux conformes aux questions d'éthique de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO) Déclaration de l'…

Representative Results

Après plusieurs mois de tests, nous avons découvert que le démasquage chimique à base de chaleur latente fait HSV-1 génome disponible pour hybridation fluorescente in situ. Au cours du processus, nous avons essayé différentes procédures démasquer, et les traitements ne chaleur à base (c.-à-chauffer les sections à la température sous-ébullition dans un four à micro-ondes) comparu efficace. Nous avons ensuite testé plusieurs tampons de sel qui sont couramment utilisés en immunohistochimi…

Discussion

Le protocole décrit ici permet la détection de HSV-1 génome latent dans les neurones de coupes de tissus neuronaux de souris. Notre compréhension des voies de régulation de l'expression des gènes viraux a été limitée par l'absence de méthode pour détecter le HSV-1 de l'ADN génomique in situ dans les tissus neuronaux. Informations sur le génome nombre de copies et la proportion de neurones infectés provenaient principalement de l'analyse par PCR sur les neurones dissociés ^11,1…

Materials

Balb/c mice	Janvier, France		6 week-old females
HSV-1 strains	SC16 strain (wild type)		See Labetoule, M. et al. (2003) Invest Ophthalmol Vis Sci 44: 217–225, for details on HSV-1 strain and virus stock preparation.
Ketamine hydrochloride	Sigma	K2753	Intraperitoneal injection of a solution containing Ketamine (100mg/kg) and Xylazine (10mg/kg)
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127	Suspend 4g of PFA in 90mL of water. Add 50µL of 1N NaOH, and heat at 60°C in a water bath with agitation. PFA dissolves in about 30min. Add 10mL of 10X PBS. This solution can be prepared in advance and stored at -20 °C in 5mL tubes. Caution. Manipulate under a fume hood.
Physiological Saline	Sigma	07982-100TAB-F
1X PBS, pH 7.4 (sterile)	Life Technologies	10010-015
Sucrose	Sigma	84100	Prepare a 20% sucrose solution in 1X PBS.
Cryosectionning embedding medium – Tissue-Tek OCT Compound –	SAKURA	4583
Large vector DNA purification kit	Qiagen	12462	To purify Cosmid or BAC vector containing HSV-1 genome and store at -20°C
Nick translation kit	Roche Applied Sciences	10 976 776 001
Cy3-dCTP	GE Healthcare	PA53021	Protect from light
0.5M EDTA	Sigma	E6758
G50 Mini spin column	GE Healthcare	27-5330-01
Salmon sperm DNA 10mg/mL	Invitrogen / Life Technologies	15632-011
Ethanol molecular biology grade	Sigma	87047	Prepare a 70% solution
Salmon sperm DNA	Invitrogen / Life Technologies	15632-011
Formamid Molecular biology grade	Sigma	F9037	Caution. Manipulate under fume hood.
HSV-1 biotinylated commercial probe	Enzo Life Sciences	ENZ-40838
ImmEdge hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
20X Saline Sodium Citrate (SSC)	Sigma	S6639	Prepare a 2X SSC solution in ddH20.
Triton X-100	Sigma	T8787	Prepare a 10% stock solution in water and store at +4°C. Prepare the 0.5% solution in 1X PBS right before use.
10mM sodium citrate pH 6.0	Sigma	S1804	Prepare a 100mM stock solution (10X). Weigh 10,5g of citric acid (MW 210.14. Caution, irritant and toxic, wear appropriate mask and gloves), and dissolve in 400mL water. Adjust pH at 6.0 with 1N NaOH (caution, irritant, wear gloves). Adjust to 500mL with distilled water. Dilute 10 times in distilled water before use.
Acetic Acid	Sigma	320099
Methanol, molecular biology grade	Sigma	322415
Dextran sulfate – MW 500 000	Euromedex	EU0606-A
Denhardt's solution (100X)	Euromedex	1020-A
Rubber Cement "FixoGum"	Marabut	290110000
DNA purification kit – Qiaquick PCR purification kit –	Qiagen	28104
T7 in vitro transcription kit	Ambion / Life Technologies	AM1314
Biotin-16-UTP	Roche Applied Sciences	11388908910
RNA purification mini-column	Qiagen	73404
Ribonucleoside Vanadyl Complex	New England Biolabs	S1402S
H2O2	Sigma	H3410	Prepare a 3% solution in distilled water. Store at +4 °C and protect from light.
Yeast tRNA	Invitrogen	15401011	prepare a 10mg/mL solution in RNAse free water
Normal Goat Serum	Invitrogen	PCN5000
Primary antibodies	Any supplier		The following primary antibodies were used in the result section: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies), and anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
Secondary fluorescent antibodies	Invitrogen / Life Technologies		The fluorescent secondary antibodies routinely used in our protocol are AlexaFluor labeled goat antibodies (IgG H+L). The antibody used in the result section is an anti-rabbit goat antibody labaled with AlexaFluor 488 (reference A11001)
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 350 (blue fluorescence)	Invitrogen / Life Technologies	#T20937	TSA kits are also available from Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification (TSA) kit – Streptavidin + AlexaFluor 488 (green fluorescence)	Invitrogen / Life Technologies	#T20932
Hoechst 33342	Invitrogen / Life Technologies	H3570	Prepare a 0.5µg/mL solution in 1X PBS immediatly before use. Discard the remaining solution.
22x50mm coverslip. n°1.5 glass.	Electron Microscopy Sciences	72204-04
Mounting medium with anti-fading agent – Vectashield –	Vector Laboratories	H-1000	Another conventional product is Fluoromount G from electron microscopy Science
Superfrost glass slides	FisherScientific	12-550-15
EQUIPMENT
Equipment / material	Company	Reference	Note
Needle for infection			Glass micropipette hot drawn. Home made.
Dissection equipement	Moria, France		Microsurgical scissors and forceps
Peristaltic pump	Cole Palmer Instruments		Easyload Masterflex
Micro-syringe pump device (Nano Pump)	kdScientific	KDS310
Cryostat	Leica France	CM 1510-1
-80 °C freezer	Sanyo		Ultra Low -80°C
Domestic microwave oven
Dry block heater	Eppendorf	022670204
Incubator Slide moat	Boekel Scientific	240000
Coplin Jar	Dominique Dutscher	68512
Staining glass container	Dominique Dutscher	68506
Fluorescent microscope	Zeiss		The images presented in the result section were collected with a Zeiss AxioObserver with objective x40 LD NeoFluor N.A 0.6, and x100 PlanApochromat N.A 1.3. Filter set #38, #43 and #43. HXP 120 fluorescence light source. Photometrics CoolSNAP HQ2 CCD camera. Signal will be more easily observed on a recent high efficiency microscope such as Zeiss AxioImager/AxioObserver series, Nikon Ti-E/Ni-E series or Leica DM/DMI6000 series