دراسة الهجرة خلية في القنوات Microfabricated
Summary
يوصف الأسلوب الكمي لدراسة الهجرة عفوية من الخلايا في المكروية يقتصر ذات بعد واحد. هذا الأسلوب يستفيد من القنوات microfabricated، ويمكن استخدامها لدراسة هجرة عدد كبير من الخلايا تحت ظروف مختلفة في التجارب واحد.
Abstract
الطريقة الموضحة هنا يسمح دراسة الهجرة الخلية تحت الحبس في بعد واحد. لأنه يقوم على استخدام القنوات microfabricated، التي تفرض النمط الظاهري الاستقطاب إلى الخلايا عن طريق القيود المادية. مرة واحدة داخل القنوات، وخلايا لديها سوى احتمالين: التحرك إلى الأمام أو الخلف. هذه الهجرة مبسطة الذي يقتصر الاتجاهية يسهل التتبع التلقائي للخلايا واستخراج المعلمات الكمي لوصف حركة الخلية. وتشمل هذه مؤشرات قوة الاندفاع الخلية، والتغيرات في الاتجاه، وتوقف أثناء الحركة. Microchannels هي أيضا متوافقة مع استخدام علامات الفلورسنت، وبالتالي فهي مناسبة لدراسة توطين عضيات داخل الخلايا والهياكل أثناء الهجرة الخلية بدقة عالية. أخيرا، والسطح من القنوات يمكن بين functionalized مع ركائز مختلفة، والسماح للسيطرة على خصائص لاصقة من القنوات أو دراسة haptotaxis. وباختصار، فإن نظام حيحرث صفها يهدف إلى تحليل هجرة أعداد الخلايا الكبيرة في الظروف التي يتم التحكم كلا من الهندسة والطبيعة والكيمياء الحيوية للبيئة، وتسهيل تطبيع واستنساخ تجارب مستقلة.
Introduction
الهجرة هي وظيفة الخلوية المعقدة وهذا أمر مهم لكثير من العمليات الفسيولوجية في الكائنات متعددة الخلايا، بما في ذلك التنمية، الاستجابات المناعية، وتجديد الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، بعض الحالات المرضية مثل غزو الورم والانبثاث تعتمد على خلية حركية 1. لهذه الأسباب، فقد أصبحت الهجرة الخلية حقل رئيسي للدراسة في سياق البحوث الأساسية ومتعدية على حد سواء. في الجسم الحي، وتتميز معظم الأنسجة عن طريق مصفوفة خارج الخلية الغنية وكثافة الخلايا عالية. الهجرة الخلية وبالتالي، في ظل الظروف الفسيولوجية، ويحدث في بيئة محصورة المعقدة. كلاسيكيا، وقد درس الهجرة الخلية على الأرجح لأسباب تاريخية وحدود التقنية في أنظمة 2D المسطحة التي لا تتكاثر العديد من خصائص البيئة جدت في الأنسجة، مثل الحبس. علاوة على ذلك، عوامل مثل التصاق الخلية، التي تعتبر ضرورية لحركية في 2D، وقد أظهرت مؤخرا أن لا يكون necessaمطلوب rily للهجرة في الجسم الحي أو داخل المواد الهلامية، مما يوحي بأن الآليات التي تحكم تحرك خلية في 2D و في بيئات أخرى تختلف 2. وقد تم تطوير عدة أنظمة لمحاكاة خصائص معقدة من الأنسجة، والمواد الهلامية يجري الكولاجين الأكثر شهرة، والتي تهدف إلى تلخيص خصائص تكوين المصفوفة خارج الخلية 3. ونحن هنا نقترح microchannels كوسيلة مكملة بسيط هو أن يسمح للهجرة الخلية الدراسة في بعد واحد تحت بيئة محصورة.
في هذا النظام تهاجر الخلايا جنبا إلى جنب في microchannels التي يدخلون من تلقاء أنفسهم. الخلايا المهاجرة ثم الحصول على شكل قنوات، واعتماد هندسة أنبوبي أن يعزز على الأرجح قطبية بهم. حركة خطية من الخلايا في قنوات يسمح تتبع خلية الآلي واستخراج المعلمات كمية من التجارب. من الناحية الفنية، وهذا النظام هو سهلة ومرنة. وcoatinغرام من جدران القناة ويمكن التلاعب بها، وحجم وشكل القنوات يمكن تكييفها، ويمكن تحليل عدد كبير من الخلايا في تجارب واحد. هذا النظام يمكن زيادتها المتابعة أيضا لإجراء تحليل الشاشة متوسطة المدى من الجزيئات المشاركة في حركية الخلية. بروتوكول الموصوفة هنا كانت موحدة باستخدام الخلايا الجذعية (DC) كنموذج الخلوية. هذه الخلايا هي المفتاح لجهاز المناعة كما أنها تشارك في بدء وصيانة الاستجابات المناعية محددة 4. في المختبر، وقد تبين أن البلدان النامية إلى الهجرة بشكل عفوي في البيئات المحصورة وبالتالي فهي نموذجا جيدا لدراسة حركية خلية في microchannels 5،6 . الأهم من ذلك، هذا النظام يمكن تمديدها لتحليل الهجرة إلى أي نوع من الخلايا متحركة أخرى اللمفاويات التائية، العدلات، أو الخلايا السرطانية 7-9.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف الجهاز يتكون من microchannels كوسيلة لدراسة خصائص المهاجرة من عدد كبير من الخلايا في تجارب واحد. هذا النظام التجريبي يحاكي القيود البيئية تقتصر جدت في أنسجة الخلايا المهاجرة الذاتية. ومع ذلك، من خلال إجبار الهجرة في بعد واحد، فإنه يسهل تتبع خلية الآلي واستخراج ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين نعترف كثيرا من منصة PICT IBiSA في معهد كوري (CNRS UMR144). وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من: مجلس البحوث الأوروبي AM.LD (Strapacemi 243103)، والرابطة الوطنية لأجل الديمقراطية بحوث (ANR-09-0027-بيري-PCVI)، ومؤسسة InnaBiosanté (Micemico) الى النائب وAM. LD وERC Strapacemi منحة المحقق الشباب لAM.LD.
Materials
| PolyDimethylSiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
| Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2,5 mm |
| Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
| Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
| PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
| Y27632 | TOCRIS | 1254 |
Riferimenti
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines. J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).
- Steinman, R. M. Decisions about dendritic cells: past, present, and future. Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).
- Faure-André, G., et al. Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain. Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).
- Renkawitz, J., et al. Adaptive force transmission in amoeboid cell migration. Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).
- Jacobelli, J., et al. Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions. Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).
- Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).
- Moreau, H., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
- Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay. Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).
- Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules. Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).
- Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. Whole-Teflon microfluidic chips. PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).
- Maiuri, P., et al. The first World Cell Race. Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).
