En kvantitativ metode til at studere spontan migration af celler i en endimensional begrænset mikromiljø beskrevet. Denne fremgangsmåde drager fordel af mikrofabrikerede kanaler og kan bruges til at studere migration af et stort antal celler under forskellige betingelser i enkelte eksperimenter.
Den her beskrevne fremgangsmåde muliggør studiet af cellemigrering under indeslutning i en dimension. Den er baseret på brugen af mikrofabrikerede kanaler, der stiller en polariseret fænotype til celler med fysiske begrænsninger. Gang inde kanaler, celler har kun to muligheder: Flyt fremad eller tilbage. Denne forenklede migration, hvor retningsvirkning er begrænset letter automatisk sporing af celler og udvinding af kvantitative parametre til at beskrive celle bevægelse. Disse parametre omfatter celle hastighed, ændringer i retning, og pauser i løbet af bevægelse. Mikrokanaler er også kompatible med anvendelse af fluorescerende markører og er derfor velegnet til at studere lokalisering af intracellulære organeller og strukturer i cellemigrering ved høj opløsning. Endelig kan overfladen af kanalerne funktionaliseres med forskellige substrater, muliggør styring af de klæbende egenskaber af de kanaler eller studiet af haptotaxis. Sammenfattende systemet here beskrevet er beregnet til at analysere migration af store celleantal under forhold, hvor både geometrien og den biokemiske beskaffenhed af miljøet kontrolleres lette normalisering og reproducerbarhed uafhængige forsøg.
Migration er en kompleks cellulær funktion, som er vigtigt for mange fysiologiske processer i flercellede organismer, herunder udvikling, immunreaktioner og vævsregeneration. Desuden kan visse patologiske situationer såsom tumor invasion og metastase afhængige cellemotilitet 1.. Af disse grunde er cellemigration blevet en vigtig fagområde i forbindelse med både grundlæggende og translationel forskning. In vivo er de fleste væv er kendetegnet ved en rig ekstracellulær matrix og høj celledensitet. Cellemigrering derfor under fysiologiske betingelser, forekommer i et kompleks lukket miljø. Klassisk, sandsynligvis på grund af historiske grunde og tekniske begrænsninger, cellevandring er blevet undersøgt i flade 2D systemer, der ikke gengiver mange af de miljø egenskaber, der findes i væv, såsom indespærring. Desuden faktorer som celle adhæsion, som er afgørende for motilitet i 2D, er for nylig blevet vist ikke at være necessamært kræves for migration in vivo eller inde geler, hvilket tyder på, at de mekanismer, der regerer celle bevægelse i 2D og i andre miljøer er forskellige 2. Adskillige systemer er blevet udviklet til at efterligne de komplekse egenskaber af væv, de mest berømte væsen kollagengeler, som sigter mod opridset egenskaberne for den ekstracellulære matrix sammensætning 3. Her foreslår vi mikrokanaler som en simpel supplerende metode, der tillader undersøgelse cellemigrering i en dimension i et lukket miljø.
I dette system celler migrerer langs microchannels, som de indgår spontant. Vandrende celler derefter tilegne sig formen af de kanaler, vedtage en rørformet geometri, der mest sandsynligt styrker deres polaritet. Den lineære bevægelse af cellerne i kanalerne muliggør automatisk cellesporing og udvindingen af kvantitative parametre fra eksperimenter. Fra et teknisk synspunkt er nem og fleksibel dette system. Den coating kanalvæggene kan manipuleres, størrelsen og formen af kanalerne kan tilpasses, og et stort antal celler kan analyseres i en enkelt forsøg. Dette system kan også skaleres op til at udføre mellemlang rækkevidde skærm analyse af molekyler, der er involveret i celle motilitet. Protokollen beskrevet her er blevet standardiseret ved hjælp af dendritiske celler (DC) som en cellulær model. Disse celler er nøglen til immunsystemet som de deltager i initiering og vedligeholdelse af specifikke immunreaktioner 4.. In vitro har DCs vist sig at spontant migrere i lukkede miljøer, og er derfor en god model til at studere celle motilitet i microchannels 5,6 . Vigtigere er det, kan dette system udvides til at analysere migration af andre bevægelige celletype som T-lymfocytter, neutrofiler eller tumorceller 7-9.
Her beskriver vi en enhed bestående af mikrokanaler som en metode til at undersøge de migrerende egenskaber af store antal celler i enkelte eksperimenter. Denne eksperimentelle system efterligner de indespærrede miljømæssige begrænsninger, der findes i væv af endogene migrerende celler. Men ved at tvinge migration i en enkelt dimension, det letter automatisk cellesporing og udvindingen af measurables (figur 5). Vi viser også, at vores enhed er kompatibel med fluorescensmikroskopi og kan derfor t…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne kraftigt anerkender PICT IBiSA platform på Institut Curie (CNRS UMR144). Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra: Det Europæiske Forskningsråd til AM.LD (Strapacemi 243.103), Foreningen Nationale pour la Recherche (ANR-09-piri-0027-PCVI), den InnaBiosanté Foundation (Micemico) til MP og AM. LD og ERC Strapacemi unge investigator tilskud til AM.LD.
PolyDimethylSiloxane (PDMS) | GE Silicones | RTV615 | Package of 90% silicone base and 10% curing agent |
Core sample cutter | Ted Pella Int. | Harris Uni-Core | Diameter 2,5 mm |
Glass-bottom dish | WPI | Fluorodish FD 35-100 | |
Ultrasonic cleaner | Branson Ultrasonics | Branson 200 | |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32 G | For small samples (35 dishes). A bigger version is also available |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma Aldrich | F0895 | |
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG) | Susos | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | B2261 | |
Y27632 | TOCRIS | 1254 |