Studie van cel-migratie in Microfabricated Kanalen

Summary

Een kwantitatief spontane migratie van cellen te bestuderen in een eendimensionale beperkte micro beschreven. Deze methode maakt gebruik van microfabricated kanalen en kan worden gebruikt om de migratie van grote aantallen cellen te bestuderen onder verschillende omstandigheden in enkele experimenten.

Abstract

De hier beschreven methode maakt de studie van celmigratie onder opsluiting in een dimensie. Het is gebaseerd op het gebruik van microfabricated kanalen, die een gepolariseerde fenotype opleggen cellen door fysieke beperkingen. Eenmaal binnen kanalen, cellen hebben slechts twee mogelijkheden: vooruit of achteruit. Deze vereenvoudigde migratie waarbij gerichtheid beperkt vergemakkelijkt het automatisch volgen van cellen en de extractie van kwantitatieve parameters naar cel beweging te beschrijven. Deze parameters omvatten cel snelheid, veranderingen in richting en pauzes tijdens beweging. Microkanalen zijn ook compatibel met het gebruik van fluorescente merkers en zijn daarom geschikt voor lokalisatie van intracellulaire organellen en structuren bestudeerd worden celmigratie met hoge resolutie. Tenslotte kan het oppervlak van de kanalen worden gefunctionaliseerd met verschillende substraten, zodat de controle van de hechting van de kanalen of de studie van haptotaxis. Kortom, het stelsel here beschreven is bedoeld om de migratie van grote celaantallen analyseren omstandigheden waarin zowel de geometrie en de biochemische aard van de omgeving worden geregeld, de normalisatie en reproduceerbaarheid onafhankelijke experimenten vergemakkelijken.

Introduction

Migratie is een complexe cellulaire functie is belangrijk voor veel fysiologische processen in multicellulaire organismen, zoals ontwikkeling, immuunresponsen en weefselregeneratie. Bovendien zijn bepaalde pathologische situaties zoals tumor invasie en metastase afhankelijk celmotiliteit ^1. Daarom is celmigratie een belangrijke vakgebied in de context van zowel fundamenteel en translationeel onderzoek. In vivo, worden de meeste weefsels gekenmerkt door een rijke extracellulaire matrix en hoge celdichtheid. Celmigratie derhalve onder fysiologische omstandigheden treedt in complexe afgesloten omgeving. Klassiek, waarschijnlijk te wijten aan historische redenen en technische grenzen, cel migratie is onderzocht in platte 2D-systemen die niet veel van de milieu eigenschappen gevonden in weefsels, zoals opsluiting niet reproduceren. Bovendien factoren celadhesie, die essentieel zijn voor motiliteit in 2D zijn, zijn onlangs bleek niet noodzakelijkerwijs teRily vereist voor migratie in vivo of in gels, wat suggereert dat de mechanismen die cel motoriek regeren in 2D en in andere omgevingen zijn te onderscheiden ^2. Verschillende systemen zijn ontwikkeld om de complexe eigenschappen van weefsels, de bekendste wezen collageen gels, die erop gericht indient de eigenschappen van de extracellulaire matrix samenstelling ³ nabootsen. Microchannels Hier stellen we als een eenvoudige aanvullende methode die de studie cel migratie in een dimensie maakt het mogelijk onder een afgesloten omgeving.

In dit systeem migreren cellen langs microkanalen waarin ze binnenkomen spontaan. Migrerende cellen vervolgens te verwerven van de vorm van de kanalen, de aanneming van een buisvormige geometrie die het meest waarschijnlijk versterkt hun polariteit. De lineaire beweging van de cellen in de kanalen kan automatisch cell tracking en extractie van kwantitatieve parameters experimenten. Vanuit technisch oogpunt, dit systeem is eenvoudig en flexibel. De coating de kanaalwanden kan worden gemanipuleerd, de grootte en de vorm van de kanalen worden aangepast, en een groot aantal cellen in enkele experimenten worden geanalyseerd. Dit systeem kan ook worden opgeschaald tot middellange afstand zeefanalyse van moleculen betrokken bij celbeweeglijkheid voeren. De hier beschreven protocol is gestandaardiseerd op basis van dendritische cellen (DC) als een cellulair model. Deze cellen zijn essentieel voor het immuunsysteem zij deelnemen aan de initiatie en handhaving van specifieke immuunresponsen ^4. In vitro is aangetoond DC spontaan migreren begrensde omgevingen en dus een goed model motiliteit van cellen te bestuderen in microkanalen ^5,6 . Belangrijk, kan dit systeem worden uitgebreid tot migratie van andere beweeglijke celtype als T-lymfocyten, neutrofielen of tumorcellen ^7-9 analyseren.

Protocol

Belangrijke opmerking: Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de mal met de vorm voor de gewenste microkanalen is al gemaakt. Nadere informatie over de voorbereiding van de mal is reeds gepubliceerd 10. Dit protocol wordt ook aangenomen dat het beenmerg DCs cultuur is bekend. 1. Chip Fabrication Meng PDMS olie en verharder in een gewichtsverhouding 10:01 in een plastic beker. Meng beide verbindingen grondig. Wierp de mix over de mal lager micr…

Representative Results

In elk experiment het oppervlak van het PDMS is bedekt met een molecuul ingericht om het belang van de studie. Figuur 2 toont kanalen bekleed met een fluorescerend molecuul, PLL-g PEG, voor en na het wassen (stap 2.4). Een dergelijke proef kan de controle van de homogeniteit van de coating in de kanalen. Na cel laden, kan video microscopie worden uitgevoerd om celmigratie te volgen. Figuur 3A toont een voorbeeld van DC migreren in microkanalen met een dichth…

Discussion

Hier beschrijven we een inrichting bestaande uit microkanalen als een methode om de trekkende eigenschappen van grote aantallen cellen in enkele experimenten bestuderen. Deze experimentele systeem bootst de beperkte milieu-eisen gevonden in weefsels door endogene migrerende cellen. Echter, door het forceren migratie in een dimensie, vergemakkelijkt automatisch cell tracking en winning van measurables (figuur 5). We tonen ook dat ons apparaat compatibel is met fluorescentie microscopie en derhalve worden…

Materials

PolyDimethylSiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2,5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254