Studio della Migrazione cellulare in canali microfabbricati

Summary

Un metodo quantitativo per studiare la migrazione spontanea di cellule in un microambiente confinato unidimensionale è descritto. Questo metodo sfrutta canali microfabbricati e può essere usato per studiare la migrazione di un gran numero di cellule in condizioni diverse in singoli esperimenti.

Abstract

Il metodo qui descritto consente di studiare la migrazione delle cellule sotto confinamento in una dimensione. Si basa sull'uso di canali microfabbricati, che impongono un fenotipo polarizzato a cellule da limitazioni fisiche. Una volta che i canali interni, le cellule hanno solo due possibilità: andare avanti o indietro. Questa migrazione semplificata in cui direzionalità è limitato facilita il tracciamento automatico delle celle e l'estrazione di parametri quantitativi per descrivere il movimento delle cellule. Questi parametri includono la velocità delle cellule, cambi di direzione, e pause durante il movimento. Microcanali sono anche compatibili con l'uso di marcatori fluorescenti e sono quindi adatti per studiare la localizzazione di organelli e strutture intracellulari durante la migrazione cellulare ad alta risoluzione. Infine, la superficie dei canali può essere funzionalizzato con substrati differenti, permettendo il controllo delle proprietà adesive dei canali o lo studio di haptotaxis. In sintesi, il sistema here descritto è destinato ad analizzare la migrazione di grandi numeri di cellule in condizioni in cui sia la geometria e la natura biochimica dell'ambiente sono controllate, facilitando la normalizzazione e riproducibilità di esperimenti indipendenti.

Introduction

La migrazione è una funzione cellulare complessa che è importante per molti processi fisiologici negli organismi multicellulari, incluso lo sviluppo, le risposte immunitarie e la rigenerazione dei tessuti. Inoltre, alcune situazioni patologiche come invasione tumorale e metastasi basano sulla motilità cellulare ^1. Per queste ragioni, la migrazione cellulare è diventato un importante campo di studio nell'ambito della ricerca sia fondamentale e traslazionale. In vivo, la maggior parte dei tessuti sono caratterizzati da una ricca matrice extracellulare ed elevata densità cellulare. La migrazione cellulare quindi, in condizioni fisiologiche, avviene in un ambiente confinato complesso. Classicamente, molto probabilmente a causa di ragioni storiche e limiti tecnici, la migrazione delle cellule è stato studiato in sistemi 2D piatte che non riproducono molte delle proprietà ambientali presenti nei tessuti, come ad esempio confinamento. Inoltre, fattori come l'adesione cellulare, che sono essenziali per la motilità in 2D, sono stati recentemente dimostrato di non essere necessapalmente necessari per la migrazione in vivo o all'interno gel, suggerendo che i meccanismi che regolano la locomozione cella in 2D e in altri ambienti sono distinti ^2. Diversi sistemi sono stati sviluppati per imitare le proprietà complesse dei tessuti, i più noti gel dell'essere collagene, che mirano a ricapitolare le proprietà della composizione della matrice extracellulare ^3. Qui proponiamo microcanali come metodo semplice complementare che permette la migrazione delle cellule studio in una dimensione in un ambiente confinato.

In questo sistema le cellule migrano lungo microcanali in cui essi entrano spontaneamente. Cellule migranti poi acquisire la forma dei canali, adottando una geometria tubolare che molto probabilmente rafforza il loro polarità. Il movimento lineare delle cellule nei canali permette inseguimento cella automatica e l'estrazione di parametri quantitativi da esperimenti. Dal punto di vista tecnico, questo sistema è facile e flessibile. Il coating delle pareti dei canali può essere manipolato, la dimensione e la forma dei canali possono essere adattati, e un gran numero di cellule può essere analizzato in singoli esperimenti. Questo sistema può essere anche in scala ingrandita effettuare medio analisi schermata gamma di molecole coinvolte nella motilità cellulare. Il protocollo qui descritto è stato standardizzato usando cellule dendritiche (DC) come modello cellulare. Queste cellule sono fondamentali per il sistema immunitario come partecipare al procedimento e la manutenzione di risposte immunitarie specifiche ^4. In vitro, cellule dendritiche hanno dimostrato di migrare spontaneamente in ambienti confinati e sono quindi un buon modello per studiare la motilità cellulare in microcanali ^5,6 . È importante sottolineare che questo sistema può essere esteso per analizzare la migrazione di qualsiasi altro tipo di cellula mobili come T linfociti, neutrofili, o cellule tumorali ^7-9.

Protocol

Nota importante: Questo protocollo presuppone che lo stampo contenente la forma per i microcanali desiderato è stato già fatto. Ulteriori informazioni sulla preparazione dello stampo è stato già pubblicato 10. Questo protocollo presuppone inoltre che la cultura DC midollo osseo è noto. 1. Chip Fabrication Mescolare olio PDMS e l'agente indurente in un rapporto in peso 10:1 in una tazza di plastica. Mescolare accuratamente entrambi i composti. <…

Representative Results

In ogni esperimento la superficie del PDMS è rivestita con una molecola adattato all'interesse dello studio. Figura 2 mostra canali rivestiti con una molecola fluorescente, PLL-g-PEG, prima e dopo il lavaggio (passo 2.4). Un simile esperimento permette di controllare l'omogeneità del rivestimento nei canali. Dopo il caricamento delle cellule, microscopia video può essere eseguito per seguire la migrazione cellulare. Figura 3A mostra un esempio di …

Discussion

Qui si descrive un dispositivo composto di microcanali come metodo per studiare le proprietà migratorie di gran numero di cellule in singoli esperimenti. Questo sistema sperimentale imita i vincoli ambientali confinati trovati nei tessuti da cellule migranti endogene. Tuttavia, forzando la migrazione in una sola dimensione, facilita inseguimento cella automatica e l'estrazione di measurables (Figura 5). Mostriamo anche che il nostro dispositivo è compatibile con microscopia a fluorescenza e può p…

Materials

PolyDimethylSiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2,5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254