Study of Cell Migration i microfabricated Kanaler

Summary

En kvantitativ metode for å studere spontan migrasjon av celler i en en-dimensjonal begrenset mikromiljø er beskrevet. Denne fremgangsmåte utnytter microfabricated kanaler, og kan brukes til å studere migrering av store antall celler under forskjellige betingelser i enkle eksperimenter.

Abstract

Fremgangsmåten er beskrevet her tillater studiet av cellemigrasjon i lukket rom i en dimensjon. Den er basert på bruk av microfabricated kanaler, som pålegger en polarisert fenotype til celler av fysiske begrensninger. Når du er inne kanaler, celler har bare to muligheter: flytter du fremover eller bakover. Dette forenklede migrasjon der retningen er begrenset letter automatisk sporing av celler og utvinning av kvantitative parametre for å beskrive celle bevegelse. Disse parametrene inkluderer celle hastighet, endringer i retning, og pauser under bevegelse. Mikrokanaler er også kompatible med bruken av fluorescerende markører, og er derfor egnet for å studere lokalisering av intracellulære organeller og strukturer under cellemigrasjon med høy oppløsning. Til slutt, kan overflaten av kanalene bli funksjonalisert med forskjellige substrater, slik at kontrollen av de adhesive egenskaper til de kanaler eller studiet av haptotaxis. Oppsummert, systemet here er beskrevet er ment å analysere migrering av store antall celler under forhold hvor både geometri og den biokjemiske natur av miljøet er styrt, til rette for normalisering og reproduserbarheten av uavhengige eksperimenter.

Introduction

Migrasjon er en kompleks cellular funksjon som er viktig for mange fysiologiske prosesser i flercellede organismer, inkludert utvikling, immunreaksjoner, og vev gjenfødelse. I tillegg er visse patologiske situasjoner som tumor invasjon og metastase er avhengige av celle motilitet ^1.. Av disse grunner, og cellemigrasjon blitt et stort fagområde i sammenheng med både fundamentalt og translasjons-forskning. In vivo er de fleste vev, karakterisert ved en rik ekstracellulær matriks og med høy celletetthet. Cell migrering derfor under fysiologiske betingelser, forekommer i en kompleks avgrenset miljø. Klassisk, mest sannsynlig på grunn av historiske årsaker og tekniske begrensninger, celle migrasjon har blitt studert i flate 2D-systemer som ikke reproduserer mange av de miljøegenskapene som finnes i vev, for eksempel innesperring. Videre faktorer som celle adhesjon, som er avgjørende for motilitet i 2D, har blitt nylig viste å ikke være nødvendifremst nødvendig for migrasjon in vivo eller inne gels, noe som tyder på at de mekanismene som styrer celle locomotion i 2D og i andre miljøer er tydelig ^to. Flere systemer har blitt utviklet for å etterligne de komplekse egenskaper vev, den mest kjente var kollagen gels, som tar sikte på å rekapitulere egenskapene til den ekstracellulære matrise sammensetning ^tre. Her foreslår mikrokanaler som et enkelt komplementær metode som gjør det mulig å studere celle migrasjon i en dimensjon under et avgrenset miljø.

I dette systemet celler migrere langs mikrokanaler i hvilke de går inn spontant. Trekk cellene deretter skaffe formen av kanalene, å innta en rørformet geometri som mest sannsynlig forsterker deres polaritet. Den lineære bevegelse av cellene i kanalene tillater automatisk celle sporing og utvinning av kvantitative parametere fra eksperimenter. Fra teknisk synspunkt, er enkelt og fleksibelt dette systemet. Den beleg av kanalveggene kan manipuleres, er størrelsen og formen på kanalene kan tilpasses, og et stort antall celler kan bli analysert i enkle eksperimenter. Dette systemet kan også skalert opp for å utføre mellomområde siktanalyse av molekyler som er involvert i celle motilitet. Protokollen er beskrevet her er standardisert ved hjelp av dendrittiske celler (DC) som en mobil modell. Disse cellene er nøkkelen til immunsystemet som de deltar i initiering og opprettholdelse av spesifikke immunresponser ^4.. In vitro har DC vist seg å spontant migrere i lukkede omgivelser og derfor er en god modell for å studere celle motilitet i mikro ^5,6 . Viktigere, kan dette systemet bli utvidet til å analysere migrering av eventuelle andre bevegelige celletype som T-lymfocytter, nøytrofile, eller tumorceller ^7-9.

Protocol

Viktig merknad: Denne protokollen forutsetter at formen inneholder formen for de ønskede microchannels er allerede gjort. Ytterligere informasjon om utarbeidelse av formen er allerede publisert 10. Denne protokollen forutsetter også at beinmargs DCs kultur er kjent. En. Chip Fabrication Bland PDMS olje og herdemiddel i et vektforhold 10:01 i en plastkopp. Bland begge forbindelser grundig. Kast mix over mold bærende microchannels. Den totale…

Representative Results

I hvert forsøk overflaten av PDMS er belagt med et molekyl som er tilpasset til interesse for studiet. Figur 2 viser kanaler er belagt med et fluoriserende molekyl, PLL-g-PEG, før og etter vasking (trinn 2.4). Et slikt eksperiment tillater kontroll av homogeniteten av belegget i kanalene. Etter celle lasting, kan videomikroskopi utføres for å følge cellemigrering. Figur 3A viser et eksempel på DC migrere i mikrokanaler i en tetthet hensiktsmessig å sp…

Discussion

Her beskriver vi en anordning som består av mikrokanaler som en metode for å studere de trekkende egenskaper stort antall celler i enkle eksperimenter. Dette eksperimentelle systemet ligner trange miljømessige begrensninger som finnes i vev av endogene trekkende celler. Imidlertid, ved å tvinge migrasjon i en enkelt dimensjon, letter det automatiske celle sporing og utvinning av measurables (figur 5). Vi viser også at vår enheten er kompatibel med fluorescensmikroskopi, og kan derfor tilpasses for…

Materials

PolyDimethylSiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2,5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254