Studie av cellmigration i Mikrofabricerade kanaler

Summary

En kvantitativ metod för att studera spontan migration av celler i en en-dimensionell begränsas mikromiljö beskrivs. Denna metod drar fördel av mikrofabricerade kanaler och kan användas för att studera migrationen av stort antal celler under olika betingelser i enstaka experiment.

Abstract

Den metod som beskrivs här tillåter studiet av cellmigration under inneslutning i en dimension. Den är baserad på användningen av mikrotillverkade kanaler, som ställer en polariserad fenotyp till celler av fysiska begränsningar. Väl inne kanaler, celler har bara två möjligheter: flytta framåt eller bakåt. Denna förenklade migration där riktverkan är begränsad underlättar automatisk spårning av celler och utvinning av kvantitativa parametrar för att beskriva cellrörelse. Dessa parametrar inkluderar cellhastighet, riktningsförändringar, och pauser under rörelse. Mikrokanaler är också kompatibla med hjälp av fluorescerande markörer och är därför lämpliga att studera lokalisering av intracellulära organeller och strukturer under cell migration med hög upplösning. Slutligen kan ytan av kanalerna funktionaliseras med olika substrat, vilket möjliggör kontroll av de vidhäftande egenskaperna hos kanalerna eller studiet av haptotaxis. Sammanfattningsvis, systemet here beskrivas är avsett att analysera migration av stora cellantal under förhållanden i vilka både geometrin och den biokemiska naturen av miljön kontrolleras, underlätta normaliseringen och reproducerbarhet oberoende experiment.

Introduction

Migration är en komplex cellulär funktion som är viktig för många fysiologiska processer i flercelliga organismer, inklusive utveckling, immunsvar, och vävnadsregenerering. Dessutom har vissa patologiska situationer såsom tumörinvasion och metastas är beroende av cellrörlighet ^1. Av dessa skäl har cell migration blivit ett stort ämnesområde i samband med både grundläggande och translationell forskning. In vivo är de flesta vävnader kännetecknas av en rik extracellulär matrix och hög celltäthet. Cellmigration därför under fysiologiska förhållanden, förekommer i ett komplex begränsad miljö. Klassiskt, sannolikt på grund av historiska skäl och tekniska begränsningar, cellmigration har studerats i platta 2D-system som inte reproducerar många av miljöegenskaperna finns i vävnader, till exempel fångenskap. Dessutom faktorer såsom celladhesion, som är väsentliga för motilitet i 2D, har nyligen visat sig inte vara nödvändigtvisallt krävs för migration in vivo eller inuti geler, vilket tyder på att de mekanismer som styr cell locomotion i 2D och i andra miljöer är olika ^2. Flera system har utvecklats för att efterlikna de komplexa egenskaperna hos vävnader, den mest kända är kollagengeler, som syftar till att rekapitulera egenskaperna för den extracellulära matrisen sammansättningen ^3. Här föreslår vi mikrokanaler som en enkel komplementär metod som tillåter studiet cellmigration i en dimension inom en begränsad miljö.

I detta system cellerna vandrar längs mikrokanaler i vilka de kommer in spontant. Flytt celler förvärva då formen på kanalerna, anta en tubulär geometri som troligen förstärker deras polaritet. Den linjära rörelsen av cellerna i kanalerna tillåter spårning automatisk cellen och utvinning av kvantitativa parametrar från experiment. Ur teknisk synvinkel är enkelt och flexibelt detta system. Den coating kanalväggarna kan manipuleras, storleken och formen hos kanalerna kan anpassas, och ett stort antal celler kan analyseras i enstaka experiment. Detta system kan också skalas upp för att göra mediet analys intervall skärm av molekyler som är involverade i cellmotilitet. Protokollet som beskrivs här har standardiserats med hjälp av dendritiska celler (DC) som en cellulär modell. Dessa celler är nyckeln till immunsystemet som de deltar i initiering och underhåll av specifika immunsvar ^4. In vitro har DCs visats spontant vandrar i trånga miljöer och är därför en bra modell för att studera cellmotilitet i mikrokanaler ^5,6 . Viktigt kan detta system utvidgas till att analysera migration av någon annan motila celltyp såsom T-lymfocyter, neutrofiler, eller tumörceller ^7-9.

Protocol

Viktigt: Detta protokoll förutsätter att formen innehåller formen för de önskade mikrokanaler har redan gjorts. Ytterligare information om förberedelserna formen har redan publicerat 10. Detta protokoll förutsätter också att benmärgs DCs kulturen är känd. 1. Chip Fabrication Blanda PDMS olja och härdningsmedel i ett viktförhållande 10:01 i en plastkopp. Blanda båda föreningar ordentligt. Lägg upp blandningen över formen lage…

Representative Results

I varje experiment på ytan av PDMS är belagd med en molekyl som anpassas till det intresse av studien. Figur 2 visar kanaler belagda med en fluorescerande molekyl, PLL-g-PEG, före och efter tvättning (steg 2.4). Ett sådant experiment tillåter kontroll av homogeniteten hos beläggningen i kanalerna. Efter cellbelastning kan videomikroskopi utföras för att följa cellmigration. Figur 3A visar ett exempel på DC migrerar i mikrokanaler vid en densitet l…

Discussion

Här beskriver vi en enhet som består av mikrokanaler som en metod för att studera den flyttande egenskaperna hos ett stort antal celler i enskilda experiment. Detta experimentella system efterliknar de begränsade miljöbegränsningar som finns i vävnader genom endogena vandrande celler. Emellertid, genom att tvinga migration i en enda dimension, det underlättar automatisk spårning cell och utvinning av measurables (Figur 5). Vi visar också att vår enhet är kompatibel med fluorescensmikroskopi …

Materials

PolyDimethylSiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2,5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254