Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

Summary

Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.

Abstract

Burada tarif edilen yöntem, bir boyutta kapalı alan içinde hücre göçü çalışma sağlar. Bu fiziksel kısıtlamaları ile hücrelere bir polarize fenotip empoze mikrofabrike kanalların kullanımına dayanmaktadır. Ileri ya da geri hareket: kanalların içine kez hücreler yalnızca iki olasılık var. Yön sınırlı olduğu bu basitleştirilmiş göç hücrelerinin otomatik izleme ve hücre hareketini tanımlamak için sayısal parametreler çıkarma kolaylaştırır. Bu parametreler, hareket esnasında hücre hız, yön değişimleri ve duraklar içerir. Mikro kanallar da floresan markerlerin kullanımı ile uyumludur ve yüksek çözünürlükte hücre geçiş sırasında, hücre içi organel ve yapıların lokalizasyonu incelemek için uygundurlar. Son olarak, kanalların yüzeyi kanallar ya da haptotaxis çalışma yapışkan özelliklerinin kontrol etmesine izin veren, farklı alt-tabaka ile fonksiyonalize edilebilir. Özet olarak, sistem here tarif bağımsız deneyin normalleştirme ve tekrarlanabilirlik kolaylaştırılması, geometri ve çevrenin biyo-kimyasal yapısı hem de kontrol edildiği koşullarda hücre sayıları büyük göçünü analiz etmek için tasarlanmıştır.

Introduction

Göç gelişimi, bağışıklık yanıtı, doku rejenerasyonu ve da dahil olmak üzere çok-hücreli organizmada, pek çok fizyolojik süreçler için önemli olan bir kompleks hücresel fonksiyonudur. Buna ek olarak, bu tür tümör istilası ve metastaz gibi bazı patolojik durumlar, hücre motilitesi ¹ dayanır. Bu nedenlerden dolayı, hücre göçü temel ve translasyonel hem araştırma bağlamında çalışmanın önemli bir alan haline gelmiştir. In vivo, çoğu dokuların zengin hücre-dışı matris ve yüksek hücre yoğunluğu ile karakterize edilir. Hücre göçü, bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, bir kompleks kapalı bir ortamda meydana gelir. Klasik, çoğu tarihsel nedenlerden dolayı ve teknik sınırları olasılığı, hücre göçü gibi hapsi olarak dokularda bulunan çevre özelliklerinin çoğunu yeniden yok düz 2D sistemlerinde çalışılmıştır. Ayrıca, 2B motilite için gerekli olan hücre yapışması gibi faktörler, son zamanlarda necessa olmayabilir gösterdi edilmiştirrily 2B ve diğer ortamlarda hücre lokomosyonu kural mekanizmaları ² ayrı olduğunu öne sürerek, in vivo veya jellerin içinde göç için gerekli. Çeşitli hücre dışı matris sistemleri, bileşimin ³ özelliklerini yansıtan nişan dokuların, en ünlü olmak kollajen jel, karmaşık özelliklerini taklit etmek için geliştirilmiştir. Burada kapalı bir ortamda bir boyutta çalışma hücre göçünü sağlayan basit bir tamamlayıcı bir yöntem olarak mikrokanalların öneriyoruz.

Bu sistemde hücreler kendiliğinden girmek içine Mikrokanallar boyunca göç. Göç eden hücreler, daha sonra, büyük olasılıkla da bir polariteye güçlendiren boru şeklinde bir geometri benimseyerek, kanal şeklini kazanır. Kanallardaki hücrelerin doğrusal hareket otomatik hücre izleme ve deneylerden elde edilen kantitatif parametrelerin çıkarma sağlar. Görüş teknik açıdan bakıldığında, bu sistem kolay ve esnektir. Coatinkanal duvarlarının g kanalların boyutu ve şekli uyarlanabilir, manipüle edilebilir ve hücreler, çok sayıda tek deneylerde analiz edilebilir. Bu sistem aynı zamanda ölçekli yukarı olabilir hücre hareketi katılan moleküllerin orta menzilli ekran analizini gerçekleştirmek. Burada açıklanan protokol hücresel bir model olarak dendritik hücreler (DC) kullanılarak standardize edilmiştir. Bu ^4.. In vitro, DCler kendiliğinden kapalı ortamlarda geçiş gösterilmiştir spesifik bağışıklık yanıtlarının başlatılması ve bakım katılabilir ve bu nedenle mikro ^5,6 hücre hareketliliği incelemek için iyi bir model olarak bu hücreler bağışıklık sistemi için anahtar . Önemli olarak, bu sistem, T lenfositler, nötrofiller, ya da tümör hücreleri ^7-9 gibi başka bir hücre tipi hareketli göçünü analiz etmek için uzatılabilir.

Protocol

Önemli not: Bu protokol, istenen mikrokanalların şeklini içeren kalıp zaten yapılmış olduğunu varsayar. Kalıbın hazırlanması hakkında daha fazla bilgi 10, daha önce yayınlanmıştır. Bu protokol aynı zamanda kemik iliği DH'leri kültürü bilindiğini varsayar. 1.. Chip Fabrikasyon Plastik bir kap içinde bir ağırlık oranı 10:1 PDMS yağ ve sertleştirme maddesi karıştırın. İyice her iki bileşiği karıştırın. <l…

Representative Results

Her bir deneyde, PDMS yüzey çalışmanın ilgi uyarlanmış bir molekül ile kaplanır. Önce ve (adım 2.4) yıkandıktan sonra bir flüoresan molekül, PLL-PEG-g, kaplanmış Şekil 2, kanal Şekil. Böyle bir deney, kanallardaki kaplamanın homojenliği kontrol sağlar. Hücre Yükleme işleminden sonra, bir video mikroskobu hücre göçü takip gerçekleştirilebilir. Şekil 3A, DC hücreleri izlemek için uygun bir yoğunlukta mikro g…

Discussion

Burada tek deneylerde hücre sayıda göç özelliklerini incelemek için bir yöntem olarak mikro oluşan bir cihaz tarif etmektedir. Bu deneysel sistem endojen göçmen hücreler tarafından dokularda bulunan sınırlı çevresel kısıtlamalar taklit eder. Ancak, tek bir boyutta göç zorlayarak, otomatik hücre izleme ve measurables çıkarılması (Şekil 5) kolaylaştırır. Aynı zamanda cihaz floresan mikroskobu ile uyumlu olduğunu ve bu nedenle hücre motilitesini farklı aşamalarında <stron…

Materials

PolyDimethylSiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2,5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254