Undersøgelse af Cell Migration i microfabricated kanaler

Summary

En kvantitativ metode til at studere spontan migration af celler i en endimensional begrænset mikromiljø beskrevet. Denne fremgangsmåde drager fordel af mikrofabrikerede kanaler og kan bruges til at studere migration af et stort antal celler under forskellige betingelser i enkelte eksperimenter.

Abstract

Den her beskrevne fremgangsmåde muliggør studiet af cellemigrering under indeslutning i en dimension. Den er baseret på brugen af ​​mikrofabrikerede kanaler, der stiller en polariseret fænotype til celler med fysiske begrænsninger. Gang inde kanaler, celler har kun to muligheder: Flyt fremad eller tilbage. Denne forenklede migration, hvor retningsvirkning er begrænset letter automatisk sporing af celler og udvinding af kvantitative parametre til at beskrive celle bevægelse. Disse parametre omfatter celle hastighed, ændringer i retning, og pauser i løbet af bevægelse. Mikrokanaler er også kompatible med anvendelse af fluorescerende markører og er derfor velegnet til at studere lokalisering af intracellulære organeller og strukturer i cellemigrering ved høj opløsning. Endelig kan overfladen af ​​kanalerne funktionaliseres med forskellige substrater, muliggør styring af de klæbende egenskaber af de kanaler eller studiet af haptotaxis. Sammenfattende systemet here beskrevet er beregnet til at analysere migration af store celleantal under forhold, hvor både geometrien og den biokemiske beskaffenhed af miljøet kontrolleres lette normalisering og reproducerbarhed uafhængige forsøg.

Introduction

Migration er en kompleks cellulær funktion, som er vigtigt for mange fysiologiske processer i flercellede organismer, herunder udvikling, immunreaktioner og vævsregeneration. Desuden kan visse patologiske situationer såsom tumor invasion og metastase afhængige cellemotilitet ^1.. Af disse grunde er cellemigration blevet en vigtig fagområde i forbindelse med både grundlæggende og translationel forskning. In vivo er de fleste væv er kendetegnet ved en rig ekstracellulær matrix og høj celledensitet. Cellemigrering derfor under fysiologiske betingelser, forekommer i et kompleks lukket miljø. Klassisk, sandsynligvis på grund af historiske grunde og tekniske begrænsninger, cellevandring er blevet undersøgt i flade 2D systemer, der ikke gengiver mange af de miljø egenskaber, der findes i væv, såsom indespærring. Desuden faktorer som celle adhæsion, som er afgørende for motilitet i 2D, er for nylig blevet vist ikke at være necessamært kræves for migration in vivo eller inde geler, hvilket tyder på, at de mekanismer, der regerer celle bevægelse i 2D og i andre miljøer er forskellige ^2. Adskillige systemer er blevet udviklet til at efterligne de komplekse egenskaber af væv, de mest berømte væsen kollagengeler, som sigter mod opridset egenskaberne for den ekstracellulære matrix sammensætning ^3. Her foreslår vi mikrokanaler som en simpel supplerende metode, der tillader undersøgelse cellemigrering i en dimension i et lukket miljø.

I dette system celler migrerer langs microchannels, som de indgår spontant. Vandrende celler derefter tilegne sig formen af ​​de kanaler, vedtage en rørformet geometri, der mest sandsynligt styrker deres polaritet. Den lineære bevægelse af cellerne i kanalerne muliggør automatisk cellesporing og udvindingen af ​​kvantitative parametre fra eksperimenter. Fra et teknisk synspunkt er nem og fleksibel dette system. Den coating kanalvæggene kan manipuleres, størrelsen og formen af ​​kanalerne kan tilpasses, og et stort antal celler kan analyseres i en enkelt forsøg. Dette system kan også skaleres op til at udføre mellemlang rækkevidde skærm analyse af molekyler, der er involveret i celle motilitet. Protokollen beskrevet her er blevet standardiseret ved hjælp af dendritiske celler (DC) som en cellulær model. Disse celler er nøglen til immunsystemet som de deltager i initiering og vedligeholdelse af specifikke immunreaktioner ^4.. In vitro har DCs vist sig at spontant migrere i lukkede miljøer, og er derfor en god model til at studere celle motilitet i microchannels ^5,6 . Vigtigere er det, kan dette system udvides til at analysere migration af andre bevægelige celletype som T-lymfocytter, neutrofiler eller tumorceller ^7-9.

Protocol

Vigtigt: Denne protokol antager, at formen indeholder formen for de ønskede microchannels allerede er foretaget. Yderligere oplysninger om forberedelse af formen er allerede blevet offentliggjort 10.. Denne protokol forudsætter også, at knoglemarv DCs kulturen er kendt. 1.. Chip Fabrication Bland PDMS olie og hærder ved et vægtforhold 10:01 i en plastik kop. Bland begge forbindelser grundigt. Kast blandingen over formen bærende microchan…

Representative Results

I hvert forsøg overfladen af PDMS er belagt med et molekyle tilpasset interesse undersøgelsen. Figur 2 viser kanaler overtrukket med et fluorescerende molekyle, PLL-g-PEG før og efter vask (trin 2.4). Et sådant eksperiment tillader kontrol af homogeniteten af ​​belægning i kanalerne. Efter celle lastning, kan video mikroskopi udføres for at følge cellemigrering Figur 3A viser et eksempel på DC migrerer i mikrokanaler ved en densitet hensigtsmæss…

Discussion

Her beskriver vi en enhed bestående af mikrokanaler som en metode til at undersøge de migrerende egenskaber af store antal celler i enkelte eksperimenter. Denne eksperimentelle system efterligner de indespærrede miljømæssige begrænsninger, der findes i væv af endogene migrerende celler. Men ved at tvinge migration i en enkelt dimension, det letter automatisk cellesporing og udvindingen af measurables (figur 5). Vi viser også, at vores enhed er kompatibel med fluorescensmikroskopi og kan derfor t…

Materials

PolyDimethylSiloxane (PDMS)	GE Silicones	RTV615	Package of 90% silicone base and 10% curing agent
Core sample cutter	Ted Pella Int.	Harris Uni-Core	Diameter 2,5 mm
Glass-bottom dish	WPI	Fluorodish FD 35-100
Ultrasonic cleaner	Branson Ultrasonics	Branson 200
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC 32 G	For small samples (35 dishes). A bigger version is also available
Fibronectin from bovine plasma	Sigma Aldrich	F0895
PolyLysine grafted PEG (Pll-g-PEG)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	B2261
Y27632	TOCRIS	1254