En ortotopisk Glioblastoma Mouse Model Fastholdelse Brain Parenkymalt fysiske begrænsninger og velegnet til Intravital To-foton mikroskopi
Summary
Vi har etableret en kortikal ortotopisk glioblastom model i mus til intravital to-foton mikroskopi, der redegør for de biofysiske begrænsninger normalt på spil under væksten af tumoren. En kronisk glasrude erstatte kraniet over tumor muliggør opfølgning af tumorprogression over tid ved to-foton mikroskopi.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) er den mest aggressive form for hjernesvulster med ingen helbredende behandlinger til rådighed til dato.
Murine modeller af denne patologi stole på injektion af en suspension af gliomaceller i hjernen parenkym efter indsnit i dura-mater. Betragtninger cellerne skal injiceres overfladisk at være tilgængelig for intravital to-foton mikroskopi, overfladiske injektioner undlader at rekapitulere de fysiopatologiske forhold. Faktisk flygter ved injektion tarmkanalen fleste tumorceller nå det ekstra dural rum, hvor de udvider unormalt hurtigt i mangel af mekaniske begrænsninger fra parenkym.
Vores forbedringer består ikke kun i fokalt implantere en gliom sfæroid snarere end at injicere en suspension af gliomaceller i de superficielle lag af hjernebarken, men også i tilstopning injektionsstedet med en tværbundet dextrangel hemi-vulst, som er limet til LYGTding parenkym og forseglet til dura-mater med cyanoacrylat. Tilsammen disse foranstaltninger håndhæve den fysiologiske ekspansion og infiltration af tumorcellerne inde i hjernen parenkym. Kraniotomi blev endeligt lukket med en glasrude cementeret til kraniet til at tillade kronisk billeddannelse over uger i fravær af arvæv udvikling.
Drage fordel af fluorescerende transgene dyr podet med fluorescerende tumorceller vi har vist, at dynamikken i samspillet forekommer mellem gliomceller, neuroner (f.eks Thy1-FFP mus) og vasculature (fremhæves med en intravenøs injektion af et fluorescerende farvestof) kan visualiseres ved intravital to-foton mikroskopi under progression af sygdommen.
Muligheden for at billedet en tumor ved mikroskopisk opløsning i et minimalt kompromitteret cerebral miljø repræsenterer en forbedring af de nuværende GBM dyremodeller, som skulle komme inden for neuro-onkologi og narkotika testning. </p>
Introduction
Glioblastoma multiforme forekommer som den mest aggressive form for hjernesvulst hos voksne med en median overlevelse på 12 måneder og en 5-års overlevelse på 5%. Klinisk forvaltning afhængig kirurgi, strålebehandling og kemoterapi anvendes ofte i kombination. Men effekten af disse behandlinger er fortsat palliativ 1-3.
Indtil nu er de fleste af neuro-onkologiske undersøgelser beror på teknikker, som kun er i stand til at give et statisk syn og udføres på store grupper af tumorbærende dyrene aflivet på forskellige tidspunkter (se for eksempel 4,5). Den seneste udvikling af follow-up-metoder baseret på intravital billedbehandling giver studere gliom vækst og samspillet mellem tumorceller og deres patofysiologiske mikromiljø på det samme dyr over tid. Dette baner vejen for eksklusiv stykke af oplysninger, der var så langt uopnåelig 6. Transgene dyr, der udtrykker fluorescerende tags i celler af interesse kan være brugd til at undersøge specifikke interaktioner mellem tumorceller og fx neuroner i dette papir.
Gennem det seneste årti, har intravital to-foton mikroskopi 7 bliver en guldstandard i grundlæggende neuro-onkologiske undersøgelser og prækliniske forsøg 8,9 for sin evne til at udføre dybe intravital observation af mus hjerne (> 500 um under dura-mater) med mikrometrisk rumlig opløsning 10. Ved hjælp af intravital to-foton mikroskopi med orthotopical dyremodeller implanteret med en kronisk kranie vindue 11, er det muligt at følge tumorprogression over tid på den samme mus 9,12.
En af de store ulemper ved disse tidligere offentliggjorte dyremodeller er imidlertid, at de ikke efterligner de fysiske begrænsninger, der styrer tumorvækst dura-mater ikke er forseglet efter injektion af cellesuspensionen 9,13,14. Gliomaceller kan lække iextradural rum omdanne en ortotopisk gliom model i en heterotopisk én.
Dyremodellen her består i injektion af en sfæroid af fluorescerende gliomaceller i hjernebarken i en dybde på 200 um efterfulgt af forsegling af dura-mater med en tværbundet dextrangel hemi-perle og histopatologisk kompatibel lim . Tumorvækst er derefter begrænset til hjerneparenkymet der fastholder patofysiologiske fysiske begrænsninger. En kronisk glasrude implanteret over tumoren tillader en nem optisk adgang for intravital to-foton mikroskopi. Brug transgene dyr, der udtrykker fluorescerende tags i celler af interesse, er det muligt at foretage en opfølgning af væksten gliom over tid og til at studere samspillet med dens mikromiljø (her med neuroner og vaskulaturen fremhævet med fluorescerende dextraner).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne fremgangsmåde giver mulighed for brug af optiske billeddiagnostiske metoder til at overvåge over dage og uger væksten af en orthotopisk implanteret gliom. Det samme dyr kan efterfølgende udsættes for stort set alle hjernen afbildningsmodalitet i løbet af patologien; endnu to-foton mikroskopi specifik forberedelse giver en unik mulighed for at opnå subcellulært opløsning inde i hjernen på levende dyr. Vores protokol har den fordel, at håndhæve tumorvæksten i cerebral parenchym end ekstra durally …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker varmt Dr. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber og A. Jaouen for nyttige drøftelser; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, personale af dyret facilitet på IBDML og personalet i PicSIL imaging platform på IBDML for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) til GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) til FD ved stipendier fra Fédération de la Recherche Médicale og Cancéropole PACA til CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
Riferimenti
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Newcomb, E., Zagzag, D., Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
