Ортотопическая Глиобластома мышь Модель Поддержание Мозг паренхимы физических ограничений и подходит для прижизненной Двухфотонное микроскопии
Summary
Мы создали корковой ортотопической модели глиобластомы у мышей для прижизненной двухфотонного микроскопии, что повторяет биофизических ограничений обычно при игре в процессе роста опухоли. Хронический стекла замена череп выше опухоли позволяет наблюдение за прогрессированием опухолевого с течением времени по двухфотонного микроскопии.
Abstract
Глиобластомой мозга (GBM) является наиболее агрессивной формой опухоли головного мозга без каких-либо лечебных процедур, доступных на сегодняшний день.
Мышиные модели этой патологии полагаться на инъекции суспензии клеток глиомы в паренхимы мозга следующей разрез твердой мозговой-матер. В то время как клетки должны быть введены поверхностно, чтобы быть доступным для прижизненной двухфотонного микроскопии, поверхностные инъекции не в Повторим патофизиологические условия. Действительно, спасаясь через инъекции тракта большинство опухолевые клетки достигают экстра-дурального пространства, где они расширить аномально быстро в отсутствии механических ограничений из паренхимы.
Наши улучшение состоит не только в фокально имплантации глиомы сфероид, а не путем инъекций суспензии клеток глиомы в поверхностных слоях коры головного мозга, но и в засорение место инъекции с помощью сшитого декстрана гель геми-шарик, который приклеен к surrounдинь паренхимы и опечатаны в длительности матер с цианоакрилата. В целом эти меры применять физиологический расширение и проникновение опухолевых клеток внутри паренхимы мозга. Краниотомия был окончательно закрыт с оконное стекло укрепил к черепу, чтобы позволить хронический изображений над недель в отсутствии развития рубцовой ткани.
Воспользовавшись люминесцентных трансгенных животных, привитых с люминесцентными опухолевых клеток, мы показали, что динамика взаимодействий, происходящих между клеток глиомы, нейронов (например Thy1-CFP мышей) и сосудистой (выделено внутривенной инъекции флуоресцентного красителя) могут быть визуализированы прижизненный двухфотонного микроскопа во время прогрессирования заболевания.
Возможность изображение опухоли на микроскопическом резолюции в минимально угрозу головного среды представляет собой улучшение существующих моделей GBM животных, которые должны принести пользу поле нейро-онкологии и тестирования на наркотики. </p>
Introduction
Глиобластомой мозга появляется как наиболее агрессивной формой опухоли головного мозга у взрослых с медианой выживаемости 12 месяцев и 5-летняя выживаемость 5%. Тактика ведения зависит от хирургии, лучевой и химиотерапии часто используется в комбинации. Тем не менее, влияние этих методов лечения остаются паллиативной 1-3.
До сих пор, большинство из нейро-онкологии исследований полагаются на методы, которые может предоставить только статический вид и выполненных на больших когорт животных с опухолью в жертву на разных временных точках (см., например, 4,5). Недавнее развитие методов Последующие меры на основании прижизненной визуализации позволяет изучать рост глиомы и взаимодействия между опухолевыми клетками и их патофизиологической микросреды на того же животного в течение долгого времени. Это открывает путь к эксклюзивному часть информации, которая была до сих пор недостижимым 6. Трансгенные животные, выражающие флуоресцентные метки в клетках интерес могут быть использованыг для изучения конкретных взаимодействий между опухолевыми клетками, а, например нейронов в этой статье.
За последние десять лет, прижизненный двухфотонного микроскопии 7 стала золотым стандартом в фундаментальных исследованиях нейро-онкологии и доклинических испытаний 8,9 для его способности выполнять глубокий прижизненный наблюдение мозга мыши (> 500 мкм ниже длительности матер) с микрометрический пространственное разрешение 10. Использование прижизненной двухфотонного микроскопа с ортотопической модели животных с имплантированными хронического черепной окна 11, можно следовать прогрессии опухоли с течением времени на той же 9,12 мыши.
Одним из основных недостатков этих ранее опубликованных моделей на животных, однако, что они не имитировать физические ограничения, которые регулируют рост опухоли как твердая мозговая оболочка-не запечатан после инъекции суспензии клеток 9,13,14. Клеток глиомы могут протекать вэкстрадуральная пространство преобразования ортотопической глиомы в гетеротопической один.
Животной модели, представленные здесь, состоит в инъекции сфероида флуоресцентных клеток глиомы в коре головного мозга на глубину 200 мкм с последующим уплотнением твердой мозговой оболочки-с сшитого декстрана гель геми-шарика и гисто-совместимый клея . Рост опухоли затем ограничивается паренхимы мозга, который поддерживает патофизиологические физические ограничения. Окно хронический стекло имплантировали выше опухоли позволяет легко оптического доступа для прижизненной двухфотонного микроскопии. Использование трансгенных животных выражения флуоресцентные метки в клетках интереса можно выполнить наблюдение за ростом глиомы в течение долгого времени и изучить его взаимодействие с его микросреды (здесь с нейронами и сосудистой выделенных с люминесцентными декстраны).
Protocol
Representative Results
Discussion
Такой подход позволяет использовать методы оптических изображений для мониторинга за дни и недели рост на ортотопически имплантированного глиомы. То же самое животное может впоследствии быть подвергнут практически любого визуализации головного мозга модальности в ходе патологии; е…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы тепло поблагодарить д-ра К. К. Фенрих, доктор MC. Amoureux, П. Вебер и А. Jaouen за полезные обсуждения; М. Hocine, С. Менье, М. Metwaly, С. Bensemmane, Дж. Bonnardel, сотрудники вивария при IBDML и персонала изображений платформы PicSIL на IBDML на техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами от Национального института дю рака (ИНКА-DGOS-INSERM6038) в ОТО, Национальное агентство по де-ла-Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), федерация Pour La по исследованиям Cerveau (FRC) для ФО, на стипендии из федерации де-ла-Recherche Médicale и Cancéropole Лазурный Берег в ЧР.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
Riferimenti
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Newcomb, E., Zagzag, D., Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
