En Orthotopic Glioblastoma musmodell Underhålla hjärnan parenkymal fysiska begränsningar och Passar Intravital Två-foton mikroskopi
Summary
Vi har etablerat en kortikal orthotopic glioblastom modell hos möss för intravital två foton mikroskopi som rekapitulerar de biofysiska begränsningar normalt på spel under tillväxten av tumören. En kronisk glasfönster ersätter skallen ovanför tumören möjliggör uppföljning av tumörprogression över tiden genom att två-foton-mikroskopi.
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) är den mest aggressiva formen av hjärntumörer utan botande behandlingar som är tillgängliga hittills.
Murina modeller av denna patologi förlita sig på injektion av en suspension av gliomaceller i hjärnparenkymet följande snitt av dura-mater. De celler måste injiceras ytligt att vara tillgänglig för intravital två foton mikroskopi, ytliga injektioner misslyckas med att rekapitulera de fysiopatologiska förhållanden. Faktum är att fly genom injektionskanalen flesta tumörceller når den extra-dural utrymme där de expanderar onormalt snabbt i avsaknad av mekaniska begränsningar från parenkymet.
Våra förbättringar består inte bara i fokalt implantera en gliom sfäroid snarare än att injicera en suspension av gliomaceller i de ytliga lagren av hjärnbarken, utan även i tilltäppning injektionsstället genom att en tvärbunden dextrangel hemi-vulst som är limmad till den omgiding parenkymet och tätas till dura-mater med cyanoakrylat. Sammantaget dessa åtgärder genomdriva den fysiologiska expansion och infiltration av tumörcellerna inuti hjärnparenkymet. Kraniotomi slutligen avslutades med ett glasfönster cementerad på skallen för att tillåta kronisk avbildning över veckor i frånvaro av ärrvävnad utveckling.
Med utnyttjande av fluorescerande transgena djur ympade med fluorescerande tumörceller vi har visat att dynamiken i samspelet som uppstår mellan gliomceller, neuroner (t.ex. Thy1-GFP möss) och kärl (markeras av en intravenös injektion av en fluorescerande färg) kan visualiseras genom intravital två-foton-mikroskopi under utvecklingen av sjukdomen.
Möjligheten att avbilda en tumör på mikroskopisk upplösning i ett minimalt nedsatt cerebral miljö är en förbättring av nuvarande GBM djurmodeller som bör gynna området neuro-onkologi och drogtester. </p>
Introduction
Glioblastoma multiforme visas som den mest aggressiva formen av hjärntumör hos vuxna med en medianöverlevnad på 12 månader och en 5-års överlevnad på 5%. Klinisk ledning bygger på kirurgi, strålbehandling och kemoterapi ofta i kombination. Men effekterna av dessa behandlingar förblir palliativ 1-3.
Hittills har de flesta av neuro-onkologi studier förlitar sig på tekniker som bara kan ge en statisk syn och utförs på stora grupper av tumörbärande djur avlivades vid olika tidpunkter (se t.ex. 4,5). Den senaste utvecklingen av uppföljning metoder baserade på intravital imaging tillåter studera gliom tillväxt och samspelet mellan tumörceller och deras patofysiologiska mikromiljö på samma djur över tiden. Detta öppnar vägen till exklusivt bit information som var så långt ouppnåeligt 6. Transgena djur som uttrycker fluorescerande taggar i celler av intresse kan vara användningd för att studera specifika interaktioner mellan tumörceller och t.ex. nervceller i detta dokument.
Under det senaste årtiondet har intravital två foton mikroskopi 7 blivit en guldmyntfot i grundläggande neuro-onkologi studier och prekliniska studier 8,9 för sin förmåga att utföra djupa intravital observation av musen hjärnan (> 500 ^ under dura-mater) med mikrometer rumslig upplösning 10. Med hjälp av intravital två foton mikroskopi med orthotopical djurmodeller implanterade med en kronisk kraniell fönster 11, är det möjligt att följa tumörprogression över tid på samma mus 9,12.
En av de stora nackdelarna med dessa tidigare publicerade djurmodeller är emellertid att de inte efterlikna de fysiska begränsningar som reglerar tumörtillväxt som dura-mater inte förslutits efter injektion av cellsuspensionen 9,13,14. Gliomceller kan läcka iextradural utrymme omvandla en orthotopic gliom modell i en heterotopisk ett.
Modellen djur presenteras här består i insprutning av en sfäroid av fluorescerande gliomceller i hjärnbarken på ett djup av 200 | im, följt av förslutning av dura-mater med en tvärbunden dextrangel hemi-pärla och histo-kompatibelt lim . Tumörtillväxten är då begränsat till hjärnparenkymet som bibehåller patofysiologiska fysiska begränsningar. En kronisk glasfönster implanteras ovanför tumören gör en enkel optisk access för intravital två foton mikroskopi. Med hjälp av transgena djur som uttrycker fluorescerande taggar i celler av intresse är det möjligt att utföra en uppföljning av gliom tillväxt över tiden och att studera dess interaktion med sin mikromiljö (här med nervceller och kärl markerade med fluorescerande dextraner).
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att använda optiska avbildningsmetoder för att övervaka över dagar och veckor framväxten av en orthotopically implanterad gliom. Samma djur kan därefter utsättas för i stort sett alla hjärn avbildningsmodalitet under loppet av patologin; men de två-photon mikroskopi specifik förberedelse erbjuder en unik möjlighet att åstadkomma subcellulär upplösning inne i hjärnan hos levande djur. Vår protokoll har den fördelen att upprätthålla tumörtillväxt i den cer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna varmt tacka Dr KK Fenrich, Dr MC. Amoureux, P. Weber och A. Jaouen för bra diskussioner; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. BONNARDEL, personalen på djuranläggningen vid IBDML och personalen på PicSIL imaging plattform IBDML för teknisk support. Detta arbete har finansierats med bidrag från Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) till GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) till FD, genom stipendier från Fédération de la Recherche Médicale och Cancéropole PACA till CR.
Materials
| Drill | Dremel (Germany) | 398 | any high quality surgical bone drill would suffice |
| Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | also sold by Harvard Apparatus |
| Tissue scissors | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Dumont tweezers M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Dental cement | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (France) | Cyanolit 201 | |
| Glass capillaries without filament | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Microliter syringe (25 µl) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| T derivation (3-way stopcock – Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (mouse adaptor) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µm beads | Available from various suppliers including Sigma (Germany) | ||
| Eye ointment | TVM (France) | Ocry-gel | |
| Fluorescence macroscope | Leica MZFLIII (Germany) | also sold by other companies | |
| Two-photon microscope | Zeiss LSM 7MP (Germany) | also sold by other companies (Nikon, …) | |
| Infrared tunable femtosecond laser (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | also sold by other companies |
Riferimenti
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680 (2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Newcomb, E., Zagzag, D., Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
