El conocimiento de la composición de la savia del floema, así como el mecanismo de su transporte de carga y de larga distancia es esencial para la comprensión de la señalización de larga distancia en el desarrollo de la planta y el estrés / respuesta patógeno y de transporte de asimilados. Este manuscrito describe la colección de exudados del floema utilizando el método de EDTA-facilitado.
El floema de plantas es esencial para el transporte de larga distancia (foto-) asimila, así como de transmitir señales de estrés biótico o abiótico. Contiene azúcares, aminoácidos, proteínas, ARN, lípidos y otros metabolitos. Aunque hay un gran interés en la comprensión de la composición y la función del floema, el papel de muchas de estas moléculas y, por tanto, su importancia en el desarrollo de la planta y la respuesta de estrés aún no se ha determinado. Una barrera para el análisis de floema radica en el hecho de que los propios sellos del floema sobre hiriendo. Como resultado, el número de plantas de las que savia del floema puede obtenerse es limitada. Un método que permite la recogida de exudados del floema a partir de varias especies de plantas sin el equipo añadido es la colección de EDTA facilitado por floema exudado se describe aquí. Si bien es fácil de usar, que hace lugar a las heridas de las células y el cuidado tiene que ser tomado para eliminar contenidos de las células dañadas. Además, varios controles para demostrar la pureza del exudadoson necesarios. Debido a que es una exudación en lugar de una colección directa de la savia del floema (no es posible en muchas especies) sólo cuantificación relativa de sus contenidos puede ocurrir. La ventaja de este método sobre los demás es que puede ser utilizado en muchas especies de plantas herbáceas o leñosas (Perilla, Arabidopsis, álamo, etc) y requiere un mínimo de equipo y la formación. Esto conduce a cantidades razonablemente grandes de exudados que pueden ser utilizados para el análisis posterior de proteínas, azúcares, lípidos, ARN, virus y metabolitos. Es bastante simple que se puede utilizar en una parte de investigación, así como en un laboratorio de enseñanza.
Las plantas no pueden moverse para escapar de condiciones adversas. Por lo tanto, tuvieron que desarrollar mecanismos para detectar el estrés ambiental, obtener y transmitir una señal relacionada con toda la planta, y ajustar en consecuencia el desarrollo. Existen dos sistemas de transporte para la distribución de agua, nutrientes y otros compuestos (señalización). El primero es el xilema; que normalmente transporta agua y minerales absorbidos por las raíces en toda la planta. El segundo es el floema. La vista de la floema ha cambiado de un sistema de transporte asimilar sencilla a un conducto para el ARN, proteínas, virus, lípidos y otras moléculas pequeñas. Desempeña un papel importante en la asimilación y transporte de nutrientes, la respuesta al estrés biótico y abiótico, así como en el crecimiento y desarrollo de plantas. Ahora se llama la "supercarretera de la información" de la planta 18.
El floema se compone de varios tipos de células: parénquima del floema, así como compañero especializada ceLLS y elementos de tamiz. El elemento de tamiz es el sitio del movimiento de larga distancia. Para permitir el flujo sin obstáculos longitudinal, elementos de tamiz están perdiendo la mayoría de los orgánulos, así como núcleos y se cree que contienen en el mejor de una maquinaria de traducción limitada 21, 33. Se cree que las células de compañía sintetizan proteínas y otros compuestos, que viajan en la corriente de floema. Estos compuestos son entonces transportados en el elemento de tamiz a través de los plasmodesmos y pueden funcionar como señales de larga distancia 4,16.
Varios grupos de compuestos se pueden encontrar en los exudados del floema:
El desafío en el trabajo con el floema de plantas reside en su capacidad para sellar heridas a sí mismo. Hay cuatro métodos principales que se utilizan para recoger exudados del floema, sin embargo, sólo funcionan en especies seleccionadas:
1) En cucurbitáceas es posible obtener cantidades razonables de floema exudado a través de recortes de la pecíolo. Una vez que la caída inicial con la contaminación de las células lesionadas se retira, es posible obtener cantidades razonablemente grandes de pura savia del floema 1, 15. Sin embargo, con el aumento de tiempo de recogida, este exudado se espesa, por lo que es cada vez más inadecuados para enfoques de cromatografía de líquidos (no publicado). Publicaciones recientes sugieren, que dependiendo de la especie, esta savia del floema se deriva de either la fascicular (FP) o la extrafascicular floema (PE) y que, mientras que sí contiene "móvil" savia del floema de los elementos de tamiz (FP), que también es propenso a la contaminación de otros tipos de células, incluyendo el xilema 40, 41 .
2) Un segundo enfoque es el de obtener savia del floema a través de cortes poco profundos o punciones en tallo o pecíolo. Este método ha sido utilizado con éxito en altramuz 17, 25, 36 cucurbitáceas, y Brassica napus 12. Aquí la contaminación de las células lesionadas es mínimo y los exudados muy puro. Sin embargo, las plantas necesitan para estar sanos y bien regada, ya que es muy difícil para perforar selectivamente sólo los elementos cribosos. Si están mellados vasos del xilema, todos exudado es arrastrado en el flujo de xilema. Esto hace que el método adecuado para plantas con pecíolos o tallos muy frágiles o altamente lignificada.
3) stylectomy áfidos pulgones permite insertar su estilete en los elementos cribosos deln retirar el pulgón con un láser. Savia del floema es exudada a través de la restante estilete 2, 9, 10, 35, 38. En teoría, cualquier planta que puede ser infectado por los áfidos se puede utilizar para este enfoque. Sin embargo, la mayoría de invernadero o administradores de cámara de crecimiento no apoyará el uso de un agente patógeno. Además, los áfidos introducen varias proteínas en el floema con su saliva 19, 33. Esto conduce a una reprogramación transcripcional limitada 30 y tiene el potencial de cambiar la composición del floema 26.
4) El método descrito aquí es la exudación EDTA-facilitado de savia del floema. Este método emplea EDTA para evitar la obturación del floema 20. EDTA quelatos de iones Ca 2 + que participarían de otra manera en los procesos que sellan el floema. Mientras que el EDTA puede conducir a daño celular 30, varios grupos han utilizado este método y se observó ningún efecto adverso de las concentraciones de EDTA de 10 mM a 20 mM sobre la ultraestructura de células o en phloem carga y transporte 5, 24. Para reducir cualquier efecto perjudicial así como la interferencia de EDTA con cromatografía y electroforesis en gel, las plantas se mueven en el agua después de 1 h, y sólo la parte posterior de la exudado se utiliza 14. Por lo tanto, en lugar de exudación en EDTA, floema se exudados en agua (EDTA-facilitado exudación). Se trata de un sencillo, de bajo costo y baja tecnología, método para la recogida de exudados del floema. Savia del floema obtenidos de este modo se puede utilizar para analizar las proteínas, moléculas pequeñas, lípidos, y ARN y se ha utilizado con éxito en muchas plantas. Si bien una cantidad limitada de experimentos se ha realizado en monocotiledóneas 11, el método parece ser más adecuado para las dicotiledóneas (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, álamo 7). Colección de exudados tiene que ocurrir en un ambiente húmedo para evitar la pérdida de exudados a través de la transpiración. Dependiendo de la planta, la incubación en EDTA durante una a dos horas essuficiente para evitar el sellado de los elementos del floema / tamiz. La colección, entonces puede ocurrir en agua. Esto tiene la ventaja de evitar el efecto negativo de EDTA tiene en la estructura celular y la estabilidad. También elimina la interferencia de EDTA con métodos como HPLC o SDS-PAGE. Se muestra como se aplica a Arabidopsis. Para las plantas más grandes, la incubación en EDTA y exudado colecciones tiene que ser ampliado y se realiza en vasos y no en tubos de reacción de 1,7 ml.
La colección de EDTA-facilitado de floema exudados es muy simple, necesita un mínimo de equipo, y es aplicable a la mayoría de las plantas. En general, este método se extiende a la capacidad de analizar exudados del floema de más especies. A pesar de que el exudado se diluye, que es fácil de recoger muchas muestras diferentes o de muchas plantas a escala hasta una gran cantidad de material. Esto entonces permite la detección de nuevos compuestos que se encuentran en muy baja abundancia y de otro modo se pasan por alto.
Este método puede ser utilizado para múltiples especies de plantas y funciona como se describe para los que se enumeran en este manuscrito. Si se exploran nuevas especies, los dos aspectos que podrían necesitar modificaciones son el número de hojas utilizadas y el tiempo de la exudación. En la mayoría de los casos, una hora exudación siete y cincuenta y cinco debe ser adecuado. Para confirmar el uso de este método para una nueva especie vegetal, exudado necesita ser recopilada y uno o más de los análisis posterior tal como se describe en el protocolo de la parte 4 nECESIDADES a realizar. Dependiendo de la intensidad de la señal observada, puede necesitar ser reducido hasta el volumen de recogida. En general, los lípidos y análisis de proteínas se requieren más material que el análisis de azúcar y el metabolito ya que los primeros son menos abundantes en los exudados del floema.
Debido a que el exudado de la colección de EDTA-facilitado consiste en superficies de corte, así como un efecto potencialmente dañino de EDTA, varios puntos tienen que ser considerados: (1) después de la una hora de incubación con EDTA, los pecíolos tienen que ser lavado a fondo. Esto elimina cualquiera de los compuestos obtenidos a partir de células heridos, así como el propio EDTA, lo que podría dañar las células o interferir con la extracción. (2) Los controles positivos y negativos deben ser incluidos para asegurar que los datos obtenidos se derivan de la savia del floema y no de las células dañadas (ver pasos críticos a continuación). (3) savia del floema contiene varias enzimas, que podrían ser activa durante la recogida de exudado. Por lo tanto, en algunos casos, puede ser útil para recoger FOr diferentes cantidades de tiempo. (4) Dado que el método implicaba exudación en agua, una cuantificación absoluta de los compuestos no es posible.
Los pasos críticos: La clave para el uso exitoso de este método es el uso de precauciones durante la manipulación de la muestra no debe dañar a las células, así como el uso de controles apropiados (véase la referencia 14.). Un control adecuado es la colección de exudados del floema sin tratamiento previo con EDTA. En este caso, el floema sellará en sí y no hay exudado puede ser recogido. Cualquier compuestos contaminantes procedentes de las células heridos serán detectados aquí. Un segundo control sería el análisis de los azúcares en el exudado. En Arabidopsis, sacarosa debe ser el metabolito predominante dentro de la savia del floema, con fructosa a la relación de sacarosa de 01:04-01:08 (ref 8, 14).
Para la extracción de ARN es necesario el uso de un inhibidor de RNAsa. Además, un control positivo de los anteriormente describiendoed ARNm floema-localizada (UBC9: enzima de conjugación de ubiquitina 9, At4g27960; 8, 14) y un control negativo de por ejemplo un ARNm cloroplasto (Rubisco LSU) son aconsejables.
Debido a que el exudado contiene enzimas activas, un curso de tiempo se aconseja para asegurar que los cambios en el perfil de floema no son simplemente debido a las variaciones en el tiempo de recogida. En algunos casos, puede ser beneficioso utilizar inhibidores de proteinasas. Sin embargo, los investigadores deben tener en cuenta, que el exudado recogido se concentra y que los compuestos añadidos se concentran en gran medida. Un segundo paso crítico en el protocolo es el recutting del pecíolo bajo EDTA. Este paso tiene un doble propósito: en primer lugar, que elimina cualquier placa de tamiz sellados mientras que la prevención de la formación de nuevas bujías permitiendo así la libre circulación de la savia del floema. En segundo lugar, se elimina la burbuja de cavitación en el xilema generado durante el corte y por lo tanto permite el transporte xilema. El tamaño de la segunda corte dependes de las plantas utilizadas. En las plantas con pecíolos más grandes que debería ser de varios milímetros (hasta 1 cm) por encima del primer corte, en plantas como Arabidopsis, 1-2 mm son suficientes.
El uso de este método puede conducir al descubrimiento de nuevos compuestos en los exudados del floema que podría haber de señalización, consecuencias para el desarrollo o biomédica. Se ha impulsado una mirada más profunda a la señalización de lípidos de larga distancia, que era un campo poco estudiado dentro de la ciencia de la planta debido a la falta de acceso al floema.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias de subvención NSF-IOS Nacional N º 1144391 de SHB.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |