Выражение функциональных рекомбинантного гемагглютинина и нейраминидазы белков от вируса H7N9 Роман гриппа Используя выражение бакуловирусной системе
Summary
Здесь мы опишем способ выразить правильно сложенные и функциональные поверхностные антигены вируса гриппа, полученные из романа китайского вируса H7N9 в клетках насекомых. Этот метод может быть адаптирован, чтобы выразить эктодомены любых вирусных или клеточных поверхностных белков.
Abstract
Система бакуловирусом выражение представляет собой мощный инструмент для экспрессии рекомбинантных белков. Здесь мы используем его для производства правильно сложенные и гликозилированного версии вируса гриппа А поверхностных гликопротеинов – гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA). В качестве примера, мы выбрали HA и NA белки, выраженные нового вируса H7N9, который недавно появился в Китае. Однако протокол может быть легко адаптирована для HA и NA белков, выраженных любой другой гриппа А и вируса B штаммов. Рекомбинантный HA (Rha) и NA (РНК) белки являются важными реагенты для иммунологических анализов, таких как ELISPOT и ИФА, и также находятся в широком использовании для стандартизации вакцины, открытия антител, выделения и характеристики. Кроме того, рекомбинантные молекулы NA могут быть использованы для скрининга низкомолекулярные ингибиторы и могут быть использованы для определения характеристик ферментативной функции НС, а также его чувствительности к противовирусных препаратов. Рекомбинантные белки HA также байнг испытания в экспериментальных вакцин на животных моделях, и вакцина на основе рекомбинантного ГК недавно получил лицензию FDA для использования в организме человека. Способ описан здесь производить эти молекулы прямо вперед и может облегчить исследование в лабораториях гриппа, так как позволяет для производства больших количеств белков быстро и по низкой цене. Хотя здесь мы сосредоточены на вирус гриппа поверхностных гликопротеинов, этот способ также может быть использован для производства других вирусных и клеточных поверхностных белков.
Introduction
В первой реакции на появление в последнее время романа H7N9 гриппа штамма вируса в Китае, мы приобрели плазмиды, несущие геномные последовательности для гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) гены первых двух изолятов. Используя эти плазмиды, мы смогли быстро построить бакуловирусные векторов экспрессии для получения рекомбинантного HA и NA в клетках насекомых. Эта система выражение хорошо известна в нашей лаборатории и доказал решающее значение для многих наших текущих исследовательских проектов 1-8. Клетки насекомых способны правильно сложить и посттрансляционно изменить сложные белки. Эти модификации включают N-гликозилирования, что очень важно для многих вирусных гликопротеинов. Таким образом, неудивительно, что система бакуловирус достаточно создана для выражения вируса гриппа поверхностные антигены. На самом деле, многие из кристаллических структур ГК и НС были решены с использованием клеток насекомых, выразил белков 9-11. Еще одно преимуществоСистема заключается в его надежных высоким содержанием белка выходом до 30 мг культуре клеток HA / л (на основе нашего опыта работы с более чем 50 различных белков HA) – следствие вирус-инфицирования в выражении от сильного промотора полиэдрина.
Удаление трансмембранным и endodomain белков HA и NA позволяет для экспрессии секретируемых, растворимых версий белков и, таким образом, значительно облегчает процесс очистки. Кроме того, эти эктодомены которые помечены гексагистидиновую и, следовательно, может быть очищен с помощью аффинной хроматографии с использованием Ni 2 +-смолы. Трансмембранные домены ГК и NA белков способствуют гомотримера и формирование гомотетрамера соответственно. Для того чтобы сохранить эти oligomerizations, мы добавляем С-концевой домен тримеризации для HA-и N-терминал тетрамеризации домена НС строит (рис. 1). Мы убедительно показали, что такая область тримеризация стабилизирует функциональное, последстrved конформационные эпитопы на стебель-домена ГК 1. Правильный тетрамеризации НС также может способствовать правильной укладки и функцию NA 10. Последовательности и векторы baculo-передачи, несущие тримеризации или тетрамеризации домены могут быть запрошены у авторов или из других лабораторий в области, 9,10,12.
Другим важным вопросом для экспрессии секретируемых белков в клетках насекомых является выбор правильного клеточной линии. В то время как Spodoptera frugiperda получены Sf9 клетки поддерживают бакуловирусной репликацию очень хорошо, и, как правило, используется для вируса спасательных и распространения, они обладают ограниченными возможностями для выделять большое количество белка. Trichoplusia Ni получены БТИ-TN-5B1-4 клеток (широко известный как High Five) имеют более высокую способность секреции и клеточная линия выбора для экспрессии в данном протоколе 13,14. Кроме того, было бы полезно, чтобы уменьшить или даже устранить фетальной бычьей сыворотки (FBS) от выражения культур. Поэтому мы используем средства массовой информации с уменьшенным (3%) содержанием FBS для выращивания рабочие запасы вируса, и мы выполняем экспрессию белка в сыворотке крови свободных СМИ.
Рекомбинантные HA и NA белки используются для многих иммунологических методов. Пожалуй, наиболее распространенным является в ИФА для измерения преобразование сыворотки после вакцинации у людей или животных 4,6,7,15. ГК и НАН также используются в ELISPOT анализов как оба стимулирующих молекул и реагентов обнаружения для антител секреции клеток 16. Их использование в качестве молекулярных приманки позволяет конкретно сортировки для plasmablasts или других типов В-клеток, которые затем могут быть использованы для выделения (терапевтических) моноклональные антитела (моноклональные антитела). Рекомбинантные HA и NA молекулы в дальнейшем используются в характеристике этих МКА 8. Другие примеры включают исследования устойчивости рН или рецептора специфику выразил различными изолятов вируса, или количественно оценки конкретных ферментативных NAдеятельность или устойчивость к ингибиторам. Кроме того, рекомбинантный очищенный HA может быть использован, чтобы стандартизировать содержание НА вируса гриппа инактивированных вакцин.
Важно отметить, что Rha (и в определенной степени NA) вакцин-кандидатов в настоящее время испытываются на животных моделях и клинических испытаниях на людях с одним кандидатом вакцин, лицензию FDA в 2013 году 2,17-19. Преимущество этих новых вакцин является то, что, в связи с рекомбинантной природе этих белков, трудоемкий процесс генерирования высоких роста реассортантных вирусов можно было бы избежать. Возможно, еще более актуальным является то, что их доходность HA высока и воспроизводится от штамма к штамму. Кроме того, поскольку эти вакцины производятся в системе без яиц, они не содержат белковые примеси, которые создают проблемы для лиц, страдающих аллергией яйцо.
Здесь мы выбрали, чтобы выразить белков HA и NA от двух изолятов романа китайской H7N9 вируса гриппа, A / Аньui/1/13 и A/Shanghai/1/13 20,21. Эти примеры своевременных, но описанный протокол может быть использован для экспрессии любого гриппа А и B НА или NA белков и может быть адаптирована, чтобы выразить любые другие секретируемые вирусных или клеточных белков. Тример или тетрамерные белки трансмембранные могут быть клонированы в кассетах экспрессии, используемых для НА и NA, соответственно. Тем не менее, наиболее растворимые секретируемые клеточные белки, как интерфероны, например, не нужен дополнительный домен для стабилизации и может быть выражена исключительно с С-концевой гексагистидиновой меткой.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя выражение вируса гриппа HA и NA белков в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы экспрессии, как правило, прямо вперед, есть несколько важных моментов, которые необходимо учитывать. Важно, как отмечалось во введении, что эктодомены ГК и НС выражены в слиянии с трим?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Patrick C. Wilson для моноклональных антител CR9114. Мы также благодарим Дженнифер Debeauchamp и Ричард Webby для оригинальных плазмид A/Anhui/1/13. Частичная поддержка для этой работы была предоставлена Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний, финансируемый Проект Программа грантов AI097092-01A1 и CEIRS (Центры передового опыта по борьбе с гриппом исследований и надзору, HHSN26620070010C). ФК была поддержана общение Эрвин Шредингер (J 3232) от Австрийским научным фондом (FWF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
Riferimenti
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
