Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l'espressione sistema Baculovirus
Summary
Qui si descrive un modo per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza piegati correttamente e funzionali derivati dal romanzo virus H7N9 cinese in cellule di insetto. La tecnica può essere adattata per esprimere ectodomains di eventuali proteine di superficie virali o cellulari.
Abstract
Il sistema di espressione baculovirus è un potente strumento per l'espressione di proteine ricombinanti. Qui usiamo per produrre versioni piegati correttamente e glicosilata del virus dell'influenza A glicoproteine di superficie del virus – l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA). Come esempio, abbiamo scelto le proteine HA e NA espresse dal virus H7N9 romanzo che recentemente emersa in Cina. Tuttavia il protocollo può essere facilmente adattato per HA e NA proteine espresse da qualsiasi altra influenza A e B ceppi virali. Proteine ricombinanti HA (umana ricombinante) e NA (RNA) sono reagenti importanti per saggi immunologici quali ELISPOT e ELISA, e sono in largo uso per il vaccino contro la standardizzazione, la scoperta di anticorpi, isolamento e caratterizzazione. Inoltre, molecole NA ricombinanti possono essere utilizzate per lo screening di piccole molecole inibitrici e sono utili per la caratterizzazione della funzione enzimatica della NA, così come la sua sensibilità ai farmaci antivirali. Proteine HA ricombinanti sono anche being testato come vaccini sperimentali in modelli animali, e un vaccino ricombinante basato su HA è stato recentemente autorizzato dalla FDA per l'uso nell'uomo. Il metodo che descriviamo qui di produrre queste molecole è semplice e può facilitare la ricerca in laboratori influenza, in quanto consente la produzione di grandi quantità di proteine veloci ea basso costo. Anche qui ci concentriamo su glicoproteine di superficie del virus dell'influenza, questo metodo può anche essere usato per produrre altre proteine di superficie virali e cellulari.
Introduction
Come prima risposta alla recente nascita del romanzo H7N9 dell'influenza ceppo del virus in Cina, abbiamo acquisito plasmidi che trasportano le sequenze genomiche per l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) geni dei primi due isolati. L'utilizzo di questi plasmidi siamo stati in grado di costruire rapidamente vettori di espressione baculovirali per la produzione di ricombinanti HA e NA in cellule di insetto. Questo sistema di espressione è ben consolidata nel nostro laboratorio e si è dimostrato fondamentale per molti dei nostri progetti di ricerca in corso 1-8. Cellule di insetto sono in grado di piegare correttamente e post-traduzionale modificare proteine complesse. Queste modifiche comprendono glicosilazione N-linked, che è importante per molte glicoproteine virali. Come tale, non è sorprendente che il sistema baculovirus è abbastanza stabilito per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza. In realtà, molte delle strutture cristalline HA e NA sono stati risolti utilizzando cellule espresso proteine insetti 9-11. Un altro vantaggio delsistema risiede nella sua affidabilità rendimenti ad alto contenuto proteico fino a 30 mg di coltura cellulare HA / L (sulla base della nostra esperienza con oltre 50 diverse proteine HA) – una conseguenza del virus-infezione espressione guidato dal promotore forte poliedrina.
La rimozione del transmembrana e endodomain delle proteine HA e NA permette a manifestare versioni secretable, solubili delle proteine e quindi facilita notevolmente il processo di purificazione. Inoltre, questi ectodomains sono hexahistidine marchiato e possono quindi essere purificati mediante cromatografia per affinità utilizzando Ni 2 +-resina. I domini transmembrana di proteine HA e NA contribuiscono omotrimero e formazione omotetramero rispettivamente. Per preservare questi oligomerizations, si aggiunge un dominio trimerizzazione C-terminale al HA-, e un dominio di tetramerizzazione N-terminale al NA costrutti (Figura 1). Abbiamo dimostrato in modo conclusivo che tale dominio trimerizzazione stabilizza funzionale, conserved epitopi conformazionali sul gambo dominio di HA 1. La corretta tetramerizzazione della NA potrebbe anche contribuire a correggere la piegatura e la funzione NA 10. Sequenze e vettori Baculo trasferimento ospitano domini trimerizzazione o tetramerizzazione possono essere richiesti da parte degli autori o da altri laboratori del settore, 9,10,12.
Un altro aspetto importante per l'espressione di proteine secrete in cellule di insetto è la scelta della linea cellulare di destra. Mentre Spodoptera frugiperda derivato cellule Sf9 supportano la replica baculovirus molto bene e sono generalmente utilizzati per il salvataggio e la propagazione del virus, hanno limitato la capacità di secernere grandi quantità di proteine. Trichoplusia ni derivato BTI-TN-5B1-4 celle (comunemente noto come High Five) avere una maggiore capacità di secrezione e sono la linea cellulare di scelta per l'espressione in questo protocollo 13,14. Inoltre, è utile per ridurre o addirittura eliminare siero fetale bovino (FBS) dalle culture di espressione. Usiamo quindi media con ridotta (3%) Contenuto FBS per la crescita degli stock di lavoro di virus, e noi eseguiamo l'espressione della proteina nel siero media liberi.
Proteine HA e NA ricombinanti sono utilizzati per vari tecniche immunologiche. Forse il più comune è in saggi ELISA per misurare la conversione del siero su di vaccinazione in esseri umani o animali 4,6,7,15. Ha e AN sono utilizzati anche in saggi ELISPOT come entrambe le molecole stimolatorie e reagenti di rilevamento per anticorpi cellule che secernono 16. Il loro impiego come esche molecolari permette di ordinare specificamente per plasmablasts o altri tipi di cellule B che possono poi essere utilizzati per isolare (terapeutici) anticorpi monoclonali (mAb). Molecole di HA e NA ricombinanti sono ulteriormente utilizzati nella caratterizzazione di questi anticorpi monoclonali 8. Altri esempi includono lo studio della stabilità del pH o della specificità del recettore di ha espresso da diversi isolati di virus, o quantitativamente valutazione specifica enzimatica NAattività o resistenza agli inibitori. Inoltre, ricombinante, HA purificato può essere utilizzato per standardizzare il contenuto di HA di vaccini a virus influenzali inattivati.
Importante, umana ricombinante (e in una certa misura NA) candidati vaccini sono attualmente in fase di sperimentazione in modelli animali e studi clinici con un vaccino candidato di essere autorizzato dalla FDA nel 2013 2,17-19. Il vantaggio di questi nuovi vaccini è che, a causa della natura ricombinante di queste proteine, il processo laborioso di generazione di virus reassortant alta crescita potrebbe essere evitato. Forse ancora più rilevante è il fatto che il loro rendimento HA è elevata e riproducibile da ceppo a ceppo. Inoltre, poiché questi vaccini sono prodotti in un sistema privo di uovo, non contengono contaminanti proteici che sono problematici per le persone con allergie uovo.
Qui abbiamo scelto di esprimere le proteine HA e NA da due isolati del virus dell'influenza romanzo cinese H7N9, A / Anhui/1/13 e A/Shanghai/1/13 20,21. Questi sono esempi tempestivi, ma il protocollo descritto può essere utilizzato per l'espressione di qualsiasi influenza A e B proteine HA o NA e possono essere adattati per esprimere eventuali altre proteine virali o cellulari secrete. Proteine transmembrana trimeric o tetramerici possono essere clonati in cassette di espressione utilizzati per HA e NA, rispettivamente. Tuttavia, proteine cellulari secrete più solubili, come interferoni per esempio, non hanno bisogno di un dominio aggiuntivo per la stabilizzazione e possono essere espressi solo con un tag hexahistidine C-terminale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se l'espressione del virus dell'influenza HA e NA proteine in cellule di insetto che utilizzano il sistema di espressione baculovirus è generalmente semplice, ci sono diversi punti importanti da considerare. E 'importante, come ricordato in premessa, che i ectodomains di HA e NA sono espressi in fusione con domini trimerizzazione o tetramerization rispettivamente. Questi domini garantiscono corretto ripiegamento delle molecole solitamente assistiti dal dominio transmembrana, che non è presente …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Patrick C. Wilson per monoclonale CR9114 anticorpo. Ringraziamo anche Jennifer Debeauchamp e Richard Webby per i plasmidi originali A/Anhui/1/13. Supporto parziale per questo lavoro è stato fornito dal National Institute for Allergy e Malattie Infettive-finanziato Progetto Programma di Grant AI097092-01A1 e CEIRS (centri di eccellenza per la ricerca e l'Influenza Surveillance, HHSN26620070010C). FK è stato sostenuto da una borsa di Erwin Schrödinger (J 3232) dal Fondo austriaco della scienza (FWF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
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