Espressione dei funzionali ricombinante emoagglutinina e neuraminidasi proteine ​​del virus Novel H7N9 Influenza utilizzando l'espressione sistema Baculovirus

Summary

Qui si descrive un modo per esprimere antigeni di superficie del virus dell'influenza piegati correttamente e funzionali derivati ​​dal romanzo virus H7N9 cinese in cellule di insetto. La tecnica può essere adattata per esprimere ectodomains di eventuali proteine ​​di superficie virali o cellulari.

Abstract

Il sistema di espressione baculovirus è un potente strumento per l'espressione di proteine ​​ricombinanti. Qui usiamo per produrre versioni piegati correttamente e glicosilata del virus dell'influenza A glicoproteine ​​di superficie del virus - l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA). Come esempio, abbiamo scelto le proteine ​​HA e NA espresse dal virus H7N9 romanzo che recentemente emersa in Cina. Tuttavia il protocollo può essere facilmente adattato per HA e NA proteine ​​espresse da qualsiasi altra influenza A e B ceppi virali. Proteine ​​ricombinanti HA (umana ricombinante) e NA (RNA) sono reagenti importanti per saggi immunologici quali ELISPOT e ELISA, e sono in largo uso per il vaccino contro la standardizzazione, la scoperta di anticorpi, isolamento e caratterizzazione. Inoltre, molecole NA ricombinanti possono essere utilizzate per lo screening di piccole molecole inibitrici e sono utili per la caratterizzazione della funzione enzimatica della NA, così come la sua sensibilità ai farmaci antivirali. Proteine ​​HA ricombinanti sono anche being testato come vaccini sperimentali in modelli animali, e un vaccino ricombinante basato su HA è stato recentemente autorizzato dalla FDA per l'uso nell'uomo. Il metodo che descriviamo qui di produrre queste molecole è semplice e può facilitare la ricerca in laboratori influenza, in quanto consente la produzione di grandi quantità di proteine ​​veloci ea basso costo. Anche qui ci concentriamo su glicoproteine ​​di superficie del virus dell'influenza, questo metodo può anche essere usato per produrre altre proteine ​​di superficie virali e cellulari.

Introduction

Come prima risposta alla recente nascita del romanzo H7N9 dell'influenza ceppo del virus in Cina, abbiamo acquisito plasmidi che trasportano le sequenze genomiche per l'emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) geni dei primi due isolati. L'utilizzo di questi plasmidi siamo stati in grado di costruire rapidamente vettori di espressione baculovirali per la produzione di ricombinanti HA e NA in cellule di insetto. Questo sistema di espressione è ben consolidata nel nostro laboratorio e si è dimostrato fondamentale per molti dei nostri progetti di ricerca in corso ^1-8. Cellule di insetto sono in grado di piegare correttamente e post-traduzionale mo....

Protocol

1. Generazione di ricombinante Baculovirus

1. Clonazione in baculovirus trasferimento-plasmidi
   1. Clone H7 HA e NA ectodomain N9 (o qualsiasi altro gene HA o NA) nella modificate trasferimento plasmidi pFastBac (vedi introduzione). Vettori per HA contenente un dominio trimerizzazione C-terminale e un tag hexahistidine, nonché per NA contenente un dominio di tetramerizzazione N-terminale e tag hexahistidine, sono stati descritti ^1,10,11,22 (Figura 1) e possono essere richieste gli autori.
      Nota esplicativa: ectodomains HA espresse senza un dominio trimerizzazione saranno piegate in modo errato, con conse....

Results

Molecole di HA da A/Shanghai/1/13 e A/Anhui/1/13 espressi bene con rese di circa 20 mg / L cultura. NA molecole di entrambi i ceppi hanno mostrato livelli di espressione moderati da 0,2 mg / L di coltura per A/Shanghai/1/13 a 0,7 mg / L per A/Anhui/1/13. Tutti e quattro i preparati proteici avevano ben poco a che nessuna impurità (Figure 8A e B) con ha l'essere di purezza superiore AN che può essere spiegato con il livello di espressione. A/Shanghai/1/13 HA è stato ulteriormente analizz.......

Discussion

Anche se l'espressione del virus dell'influenza HA e NA proteine ​​in cellule di insetto che utilizzano il sistema di espressione baculovirus è generalmente semplice, ci sono diversi punti importanti da considerare. E 'importante, come ricordato in premessa, che i ectodomains di HA e NA sono espressi in fusione con domini trimerizzazione o tetramerization rispettivamente. Questi domini garantiscono corretto ripiegamento delle molecole solitamente assistiti dal dominio transmembrana, che non è presente solo s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del materiale/ Attrezzatura		Azienda Numero di catalogo	Commenti/Descrizione
Sistema di espressione del baculovirus Bac-to-Bac	Invitrogen	10359-016	Seguire le istruzioni del produttore
TNM-FH insetto medio	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II Reagente	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA Agarosio	Qiagen	1018240
Amicon Ultra Centrigual filtri Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
Pen Strep	Gibco	15140-122
Colonne in polipropilene (5 ml)	Qiagen	34964
Efficienza massima DH10Bac batteri	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	per tamponi di eluizione e lavaggio
Sf9 celle	ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502