Uttryck av Functional rekombinant hemagglutinin och neuraminidas Proteiner från Novel H7N9 influensavirus Använda baculovirusexpressionssystem
Summary
Här beskriver vi ett sätt att uttrycka korrekt veckade och funktionella influensa Ytantigener härrör från romanen kinesiska H7N9-virus i insektsceller. Tekniken kan anpassas för att uttrycka ektodomäner av eventuella virus eller cellulära ytproteiner.
Abstract
The baculovirus-expressionssystemet är ett kraftfullt verktyg för expression av rekombinanta proteiner. Här använder vi den för att producera korrekt vikta och glykosylerade versioner av influensa A-virus ytglykoproteiner – hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA). Som ett exempel har vi valt de HA och NA-proteiner som uttrycks av den nya H7N9 virus som nyligen dykt upp i Kina. Men det protokoll enkelt kan anpassas för HA-och NA-proteiner som uttrycks av en annan influensa A och stammar B virus. Rekombinant HA (rHA) och NA (RNA) proteiner är viktiga reagenser för immunologiska analyser såsom ELISPOT och ELISA, och är också allmänt använd för vaccin standardisering, antikropps upptäckt, isolering och karakterisering. Vidare kan rekombinanta NA-molekyler användas för att screena för småmolekylära inhibitorer och är användbara för karakterisering av den enzymatiska funktionen av NA liksom dess känslighet för antivirala medel. Rekombinanta HA-proteiner är också being testas som experimentella vaccin i djurmodeller, och ett vaccin baserat på rekombinant HA nyligen licensierad av FDA för användning på människa. Den metod som vi beskriver här att producera dessa molekyler är rakt fram och kan underlätta forskning i laboratorier influensa, eftersom den möjliggör produktion av stora mängder proteiner snabbt och till en låg kostnad. Även här fokuserar vi på influensavirus ytglykoproteiner, kan metoden också användas för att producera andra virala och cellulära ytproteiner.
Introduction
Som ett första svar på den senaste tidens utveckling av romanen H7N9 influensavirus stam i Kina förvärvade vi plasmider som bär de genomsekvenser för hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) gener i de två första isolaten. Med hjälp av dessa plasmider vi kunde snabbt konstruera baculovirala expressionsvektorer för framställning av rekombinant HA och NA i insektsceller. Detta expressionssystem är väl etablerat i vårt laboratorium och har visat sig avgörande för många av våra pågående forskningsprojekt 1-8. Insektsceller har möjlighet att korrekt vika och post-translationellt modifiera komplexa proteiner. Dessa modifieringar innefattar N-länkad glykosylering, vilket är viktigt för många virala glykoproteiner. Som sådant är det inte förvånande att baculovirussystemet är ganska etablerad för att uttrycka influensavirus ytantigener. I själva verket är många av de HA-och NA-kristallstrukturer har lösts med användning av insektscell uttryckta proteiner 9-11. En annan fördel medSystemet ligger i dess pålitliga hög protein avkastning på upp till 30 mg HA / L cellodling (baserat på vår erfarenhet med mer än 50 olika HA-proteiner) – en följd av virus-infektion drivna uttryck från den starka polyhedrinpromotorn.
Borttagning av trans och endodomain av HA-och NA-proteiner möjliggör uttryck av utsöndringsbar, lösliga versioner av proteiner och på så sätt underlättar i hög grad reningsprocessen. Dessutom är dessa ektodomäner hexahistidin taggade och kan därför renas med användning av affinitetskromatografi med användning av Ni2 +-harts. De transmembrandomäner av HA-och NA-proteiner bidrar till homotrimer och homotetramer bildning, respektive. För att bevara dessa oligomerizations lägger vi en C-terminal trimeriseringsdomänen av HA-och en N-terminal tetrameriseringsdomänen till NA-konstruktionerna (Figur 1). Vi har visat entydigt att sådan trimerise domän stabiliserar funktionell, konserved konformationsepitoper på strå-domänen av HA 1. Den korrekta tetramerisation av NA kan också bidra till rätta vikning och NA-funktion 10. Sekvenser och Baculo-överföringsvektorer hyser trimerise eller tetramerisation domäner kan beställas från författarna eller från andra laboratorier i området, 9,10,12.
En annan viktig fråga för expression av utsöndrade proteiner i insektsceller är valet av den rätta cellinjen. Medan Spodoptera frugiperda härrör Sf9 celler stöder baculovirus replikering mycket bra och är i allmänhet används för virus räddning och förökning, de har begränsad kapacitet att utsöndra stora mängder protein. Trichoplusia ni härstammar BTI-TN-5B1-4-celler (allmänt känd som High Five) har en högre utsöndring kapacitet och är cellinjen valt för expression i detta protokoll 13,14. Dessutom är det bra att minska eller till och med ta bort fetalbovinserum (FBS) från expressionskulturer. Vi använder därför media med reducerad (3%) FBS innehåll för växande virusarbets lager, och vi utför proteinuttryck i serum fria medier.
Rekombinanta HA och NA-proteiner används för många immunologiska tekniker. Den kanske vanligaste är i ELISA-analyser för att mäta serumomvandling vid vaccination hos människor eller djur 4,6,7,15. Har och programkontoren används också i ELISPOT-analyser som både stimulerande molekyler och detektionsreagens för antikropps utsöndrar celler 16. Deras användning som molekylära beten tillåter att specifikt sortera för plasmablasts eller andra typer av B-celler som sedan kan användas för att isolera (terapeutiska) monoklonala antikroppar (mAb). Rekombinanta HA-och NA-molekyler vidare användas i karaktäriseringen av dessa mAbs 8. Andra exempel studera pH-stabilitet eller receptor specificitet har uttryckt av olika virusisolat, eller kvantitativt bedöma specifika NA enzymatiskaaktivitet eller resistens mot hämmare. Vidare rekombinant, renad HA kan användas för att standardisera HA innehåll av inaktiverade influensavirusvacciner.
Viktigt rHA (och till en viss grad NA) vaccinkandidater för närvarande testas i djurmodeller och kliniska försök med en vaccinkandidat licensieras av FDA under 2013 2,17-19. Fördelen med dessa nya vacciner är det, på grund av den rekombinanta karaktären av dessa proteiner, arbetsintensiv process för generering av hög tillväxt reassortant virus skulle kunna undvikas. Kanske ännu mer relevant är det faktum att deras HA avkastningen är hög och reproducerbar från stam till stam. Dessutom, eftersom dessa vacciner tillverkas i ett ägg-fria systemet, innehåller de inte proteinkontaminanter som är problematiska för individer med äggallergies.
Här valde vi att uttrycka HA-och NA-proteiner från två isolat av den nya kinesiska H7N9 influensavirus, A / Anhui/1/13 och A/Shanghai/1/13 20,21. Dessa är lägliga exempel, men den beskrivna protokollet kan användas för expression av någon influensa A och B HA eller NA-proteiner och kan anpassas för att uttrycka några andra utsöndrade virala eller cellulära proteiner. Trimera eller tetramera transmembranproteiner kan klonas in i expressionskassetterna som används för HA-och NA, respektive. Men mest lösliga utsöndrade cellulära proteiner, som interferoner till exempel, behöver inte ytterligare en domän för stabilisering och kan uttryckas enbart med en C-terminal hexahistidinmarkör.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om uttryck av influensavirus HA och NA-proteiner i insektsceller med användning av baculovirus-expressionssystem är i allmänhet rakt fram, finns det flera viktiga punkter att tänka på. Det är viktigt, som påpekats i inledningen, att ektodomäner av HA och NA uttrycks i fusion med trimerise eller tetramerisation domäner, respektive. Dessa domäner säkerställa korrekt veckning av de molekyler som vanligtvis bistås av den transmembrana domänen, som inte är närvarande om bara ektodomänen uttrycks. Till …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Patrick C. Wilson för monoklonal antikropp CR9114. Vi tackar även Jennifer Debeauchamp och Richard Webby för de ursprungliga A/Anhui/1/13 plasmider. Delvis stöd för detta arbete lämnades av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar-finansierade programmet Project Grant AI097092-01A1 och CEIRS (Centers of Excellence för influensa forskning och övervakning, HHSN26620070010C). FK fick stöd av ett Erwin Schrödinger gemenskap (J 3232) från den österrikiska Science Fund (FWF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Bac-to-Bac Baculovirus expression system | Invitrogen | 10359-016 | Follow manufacturer's instructions |
| TNM-FH insect medium | Gemini Bioproducts | 600-311 | |
| HyClone SFX-Insect | Thermo Fisher | SH30278.02 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | P/N58760 | |
| Pluronic F68 | Sigma | 1000702664 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018240 | |
| Amicon Ultra Centrigual filters Ultracel 30K | Millipore | UFC902024 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Polypropylene Columns (5 ml) | Qiagen | 34964 | |
| Max efficiency DH10Bac bacteria | Invitrogen | 10361-012 | |
| PureLink HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit | Invitrogen | K210015 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | for elution and wash buffers |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| High Five cells | Invitrogen | B85502 |
Riferimenti
- Krammer, F., et al. A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates. PLoS One. 7, e43603 (2012).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies. J. Virol. , (2013).
- Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador. Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).
- Margine, I., et al. H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice. J. Virol. , (2013).
- Miller, M. S., et al. 1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans. J. Infect. Dis. 652, (1976).
- Pica, N., et al. Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).
- Sangster, M. Y., et al. The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination. Clin. Vaccine Immunol. , (2013).
- Tan, G. S., et al. A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324, 246-251 (2009).
- Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase. J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).
- Stevens, J., et al. Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus. Science. 303, 1866-1870 (2004).
- Wei, C. J., et al. Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus. J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).
- Krammer, F., et al. Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines. Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).
- Palmberger, D., et al. Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative. J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).
- Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems. Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).
- Wrammert, J., et al. Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection. J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).
- Treanor, J. J., et al. Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial. Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).
- Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase. J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).
- Krammer, F., Grabherr, R. Alternative influenza vaccines made by insect cells. Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).
- Gao, R., et al. Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus. N. Engl. J. Med. , (2013).
- Goff, P. H., et al. Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin. J. Virol. , (2013).
- Weldon, W. C., et al. Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS One. 5, (2010).
- Dreyfus, C., et al. Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses. Science. 337, 1343-1348 (2012).
- Steel, J., et al. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).
- Fouchier, R. A., et al. Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).
- Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
