عزل وتوصيف وظيفي من الإنسان البطيني العضلية من العينات الجراحية الطازجة
Summary
المعرفة الحالية على أساس الخلوية من أمراض القلب تعتمد في الغالب على دراسات على نماذج حيوانية. نحن هنا وصف والتحقق من صحة طريقة جديدة للحصول العضلية قابلة للحياة واحد من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني الإنسان. myocytes البطين الإنسان يمكن أن تستخدم للدراسات الكهربية واختبار المخدرات.
Abstract
تخضع العضلية من قلوب المريضة إلى العمليات المعقدة التي تنطوي على إعادة عرض التغيرات في بنية الخلية، الإثارة انكماش اقتران والتيارات أيون الغشاء. ومن المرجح أن تكون مسؤولة عن زيادة خطر محدث اضطراب النظم والتعديلات التي تؤدي إلى ضعف مقلص الانقباضي والانبساطي في مرضى القلب تلك التغييرات. ومع ذلك، فقد تأتي معظم المعلومات على التعديلات وظيفة خلية عضلية في أمراض القلب من النماذج الحيوانية.
نحن هنا وصف والتحقق من صحة بروتوكول لعزل myocytes قابلة للحياة من عينات جراحية صغيرة من عضلة القلب البطيني من المرضى الذين يخضعون لعمليات جراحية في القلب. يوصف البروتوكول بالتفصيل. وذكرت القياسات الكهربية والكالسيوم داخل الخلايا لإثبات جدوى لعدد من القياسات وحيدة الخلية العضلية في البطين الإنسان التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب.
ذكرت وبروتوكول انهيمكن أن يكون مفيدا لإعادة التحقيقات مستقبل أساس الخلوية والجزيئية من تعديلات وظيفية من قلب الإنسان في وجود أمراض القلب المختلفة. علاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد أهداف علاجية جديدة على المستوى الخلوي واختبار فعالية مركبات جديدة على العضلية البشرية، مع قيمة متعدية المباشرة.
Introduction
تشريح الخصائص الكهربية لعضلة القلب قد تقدم بشكل ملحوظ بعد تطوير تقنيات لعزل واحد خلية عضلية قلبية. كما بذلت التطورات الأخيرة في فهم القلب الإثارة تقلص اقتران (EC-اقتران) بفضل القدرة على عزل العضلية واحد قابلة للحياة التي تحتفظ كافة الخصائص الفسيولوجية للأنسجة سليمة. ويعمل أساليب التصحيح المشبك بشكل روتيني لدراسة وظيفة وتعديل الدوائية للsarcolemmal القلب التيارات أيون. كما أجريت تسجيلات لديناميات الكالسيوم داخل الخلايا مع كا 2 + الأصباغ الحساسة بانتظام على myocytes القلب واحد من مجموعة متنوعة من النماذج السليمة والمريضة، وتوفير البيانات الحيوية على فسيولوجيا EC-اقتران وكذلك على التغيرات المرضية من داخل الخلايا كا 2 + مما يؤدي إلى اختلال التوازن الميكانيكية وزيادة العبء محدث اضطراب النظم في أمراض القلب. انفورمانشوئها من هذه الدراسات هو أمر حاسم لفهم الآثار الكهربية والميكانيكية المخدرات في الإعداد السريرية. ومع ذلك، هناك اختلافات محددة في الأنواع التيارات وعبر الغشاء في البروتينات EC-اقتران التي تمثل سمات محددة من إمكانات العمل القلب والميكانيكا القلب. وهكذا، في حين أوضحت دراسات myocytes المعزولة من الثدييات غير البشرية الخصائص الفيزيائية الحيوية والفسيولوجية للأدوار القنوات الأيونية عبر الغشاء محددة والبروتينات EC-اقتران، فإنها لا توفر بالضرورة النماذج ذات الصلة من myocytes القلب البشري. وبالتالي عزلة myocytes قابلة للحياة من عضلة القلب البشري هو ضروري لفهم كامل للالفيزيولوجيا المرضية لأمراض القلب والتحقق من صحة النهج العلاجية الرواية.
النسيج الأذيني الإنسان متاحة بسهولة في كثير من الأحيان يتم تجاهل الزوائد الأذيني أثناء العمليات الجراحية. الدراسات الكمية الأولي من إمكانات العمل القلب البشري الكبار ومكعب الأيونيةrrents العاملين الخلايا الأذيني معزولة إنزيمي 1-4. وقد تم الإبلاغ عن تسجيلات لإمكانات العمل أو تيارات من خلايا الإنسان البالغ البطين المعزولة في وقت لاحق 3،5-10. وقد استخدمت معظم هذه الدراسات تم الحصول عليها من خلايا قلوب explanted والاستفادة منها إما كولاجيناز نضح من شريحة الشريان التاجي أو التعرض كميات كبيرة نسبيا من الأنسجة رفعه إلى كولاجيناز للحصول على خلايا معزولة. سمحت هذه الدراسات على توصيف مفصل لعدد من التيارات عبر الغشاء أيون من العضلية البطين الإنسان من قلوب سليمة ومن المرضى الذين يعانون من قصور في القلب الطرفية. تسجيلات من نوع L-كا 2 + الحالية (I CA-L) 5-7، عابر الحالية البوتاسيوم الخارج (أنا ل) 8، الداخل المعدل الحالي البوتاسيوم (I κ1) 8، ومكونات مختلفة من تأخر المعدل الحالي البوتاسيوم (I κ ) تم الإبلاغ عن 9. السلف وتكريرالإجراء العزلة 10، يسمح للتوصيف واضح للأساس الأيونية للزيادة المحتملة محدث اضطراب النظم في فشل القلب المحطة، التي تضم 11 إطالة عمل محتمل، وتأخر بعد depolarizations 12 وزيادة مضحك الحالي 13 مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب الانبساطي ويدق سابقا لأوانه.
يتم عزل myocytes القلب الكبار عادة من الحيوانات الصغيرة عن طريق نضح الوراء من القلب كله مع خليط من مختلف انزيم، وهي تقنية التي تنتج غلة عالية من الكالسيوم 2 + الخلايا التي تتحمل 14. عزلة myocytes القلب من شظايا الأنسجة هي بطبيعتها أقل نجاحا ربما بسبب وصول محدود من الانزيمات لmyocytes الفردية مقارنة مع تلك التي نضح من الشرايين التاجية التي تحققت. بسبب توافر محدود جدا من قلوب المانحة غير المستخدمة، والطريقة العملية الوحيدة للحصول على خلايا البطين الإنسان العادي على أساس منتظم هي digestio الأنزيميةن من شظايا الأنسجة في كثير من الأحيان صغيرة جدا رفعه أثناء العمليات الجراحية الاختيارية. نموذج المرض البشري الوحيد الذي اتسم بدقة على مستوى الخلية هو قصور القلب المحطة، نظرا لإمكانية الوصول إلى قلوب المزروعة. ومع ذلك، يحدث فشل القلب محطة في أقلية من المرضى وينطوي على الطريق الشائع للإعادة حاد في خلايا عضلة القلب، وهي مستقلة نسبيا من السبب الكامن وراء 15 في كثير من الأحيان. القدرة على تقييم وظيفة العضلية واحد من المرضى في مرحلة مبكرة غير الفشل من المرض أمر حاسم لفهم الفيزيولوجيا المرضية محددة من الظروف الموروثة أو المكتسبة مختلفة. اعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) هو مثال القصص. HCM هو مشترك (1/500 فرد) حالة القلب القابلة للتوريث تتميز تضخم القلب، وزيادة خطر ومقلص التعديلات محدث اضطراب النظم بسبب انسداد المسالك وتدفق الخلل الانبساطي 16. العضلية من قلوب HCM يوndergo على عمليات إعادة معقدة تنطوي على تغييرات في هيكل الخلية (تضخم، حالة من الفوضى myofibrillar) واقتران EC-17. ومع ذلك، فقد تأتي معظم المعلومات من ضعف خلية عضلية في HCM من النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. منذ أقلية فقط من المرضى HCM تتطور نحو فشل القلب محطة ويتطلب زرع القلب، هي جدا نادرا ما تتوفر لعزل الخلايا مع الأساليب القياسية قلوب HCM. ومع ذلك، لا يقل عن 30٪ من المرضى الذين تظهر عليهم أعراض الانسداد HCM بسبب تدفق هائل الحاجز تضخم المحورة لتدفق الدم أثناء انقباض المسالك (HCM) 18. الخيار العلاجية المتاحة الأكثر فعالية للتخفيف من انسداد في HCM هو الحاجز الجراحية استئصال العضلة: خلال هذه العملية الجراحية، تتم إزالة جزء متغير الحجم من الحاجز العلوي نهج الأبهر غير المشبعة. هذا الجزء من الحاجز متضخما وبالتالي تتوفر لعزل الخلايا من أنسجة جديدة.
وهناك طريقة لعزل ventricula الإنسانص myocytes من واحد، عبر الوريد عينات خزعة شغاف وعضلة القلب صغيرة وقد وضعت سابقا ونشرت 19. نفذنا طريقة لعزل myocytes الحاجز واحد من عينات عضلة القلب البطيني من المرضى الذين يخضعون لجراحة القلب، بما في ذلك المرضى الذين يعانون من HCM تمر استئصال العضلة الحاجز والمرضى الذين يخضعون لإجراءات استبدال صمام. بالإضافة إلى وصف مفصل للبروتوكول العزلة، ممثل الكهربية والكالسيوم 2 + مضان يتم عرض القياسات، مما يدل على جدوى معزولة myocytes البطين الإنسان وجدوى المشبك التصحيح والكالسيوم داخل الخلايا 2 + دراسات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفناها والتحقق من صحتها وسيلة لعزل myocytes قابلة للحياة من عينات جراحية من عضلة القلب البطيني الإنسان. بدءا من البروتوكولات التي سبق وصفها التي استخدمت بنجاح إلى خلايا معزولة من العينات الجراحية الأذيني، والتقنية للسماح وقد وضعت فصل myocytes واحدة قابلة للحياة المريضة م?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل الاتحاد الأوروبي (بكتيريا المشروع 241577 "القلب الكبير" برنامج الإطار الأوروبي 7، CP)، الدولية لوكسمبورغ عمليات Menarini مينارينى (AM)، تيليثون GGP07133 (CP) والعلوم جلعاد (AM).
Materials
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods |
Riferimenti
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. I. Preparation of adult myocytes and their homology with the intact tissue. Cardiovascular Research. 15, 483-514 (1981).
- Dow, J. W., Harding, N. G., Powell, T. Isolated cardiac myocytes. II. Functional aspects of mature cells. Cardiovascular Research. 15, 549-579 (1981).
- Harding, S. E., et al. Species dependence of contraction velocity in single isolated cardiac myocytes. Cardioscience. 1, 49-53 (1990).
- Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart. Canadian Medical Association Journal. 126, 791-793 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Characteristics of calcium-current in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 23, 929-937 (1991).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Cohen, N. M., Lederer, W. J. Calcium current in single human cardiac myocytes. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 4, 422-437 (1993).
- Beuckelmann, D. J., Nabauer, M., Erdmann, E. Alterations of K+ currents in isolated human ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation Research. 73, 379-385 (1993).
- Virag, L., et al. The slow component of the delayed rectifier potassium current in undiseased human ventricular myocytes. Cardiovascular Research. 49, 790-797 (2001).
- Nanasi, P. P., Varro, A., Lathrop, D. A. Isolation of human ventricular and atrial cardiomyocytes: technical note. Cardioscience. 4, 111-116 (1993).
- Benitah, J. P., et al. Slow inward current in single cells isolated from adult human ventricles. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 421, 176-187 (1992).
- Verkerk, A. O., et al. Ionic mechanism of delayed afterdepolarizations in ventricular cells isolated from human end-stage failing hearts. Circulation. 104, 2728-2733 (2001).
- Cerbai, E., et al. Characterization of the hyperpolarization-activated current, I(f), in ventricular myocytes from human failing heart. Circulation. 95, 568-571 (1997).
- Kohncke, C., et al. Isolation and kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Tomaselli, G. F., Marban, E. Electrophysiological remodeling in hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research. 42, 270-283 (1999).
- Maron, B. J. Hypertrophic cardiomyopathy: a systematic review. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 287, 1308-1320 (2002).
- Olivotto, I., et al. The many faces of hypertrophic cardiomyopathy: from developmental biology to clinical practice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 349-367 (2009).
- Maron, M. S., et al. Hypertrophic cardiomyopathy is predominantly a disease of left ventricular outflow tract obstruction. Circulation. 114, 2232-2239 (2006).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Lippiat, J. D. Whole-cell recording using the perforated patch clamp technique. Methods Mol Biol. 491, 141-149 (2008).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127, 575-584 (2013).
- Kuusisto, J., et al. Low-grade inflammation and the phenotypic expression of myocardial fibrosis in hypertrophic cardiomyopathy. Heart. 98, 1007-1013 (2012).
- Yan, G. X., et al. Phase 2 early afterdepolarization as a trigger of polymorphic ventricular tachycardia in acquired long-QT syndrome : direct evidence from intracellular recordings in the intact left ventricular wall. Circulation. 103, 2851-2856 (2001).
- Yue, L., Feng, J., Li, G. R., Nattel, S. Transient outward and delayed rectifier currents in canine atrium: properties and role of isolation methods. The American Journal of Physiology. 270, 2157-2168 (1996).
- Li, G. R., Feng, J., Yue, L., Carrier, M., Nattel, S. Evidence for two components of delayed rectifier K+ current in human ventricular myocytes. Circulation research. 78, 689-696 (1996).
- Viswanathan, P. C., Shaw, R. M., Rudy, Y. Effects of IKr and IKs heterogeneity on action potential duration and its rate dependence: a simulation study. Circulation. 99, 2466-2474 (1999).
- Volders, P. G., et al. Probing the contribution of IKs to canine ventricular repolarization: key role for beta-adrenergic receptor stimulation. Circulation. 107, 2753-2760 (2003).
- Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K., Scott, A., Siegl, P. K. Isoproterenol antagonizes prolongation of refractory period by the class III antiarrhythmic agent E-4031 in guinea pig myocytes. Mechanism of action. Circulation Research. 68, 77-84 (1991).
- Coppini, R., et al. A translational approach to treatment of hypertrophic cardiomyopathy: pre-clinical rationale and design of a prospective randomized pilot trial with ranolazine. Circulation. 125, 1 (2012).
