Denne metoden forklarer hvordan du skal bygge og drive et kontinuerlig 13 C og 15 N isotop merking kammer for uniform eller differensial plantevev merking. Representative resultater fra metabolske og strukturelle merking av Andropogon gerardii blir diskutert.
Tracing sjeldne stabile isotoper fra plantemateriale gjennom økosystemet gir den mest sensitive opplysninger om økosystemprosesser, fra CO 2 flussmidler og organisk materiale i jord dannelse til småskala stabil-isotop biomarkør sondering. Kobling av flere stabile isotoper som for eksempel 13 C med 15 N, 18 O eller 2, H har potensial til å avsløre enda mer informasjon om komplekse støkiometriske forhold under biokjemiske transformasjoner. Isotop-merket plantemateriale har vært brukt i forskjellige studier av kullet nedbrytning og jord organisk materiale dannelse 1-4. Fra disse og andre studier har det imidlertid blitt klart at konstruksjonsdeler av plantemateriale oppfører seg annerledes enn metabolske komponenter (dvs.. Utlutbare lavmolekylære forbindelser) med hensyn til mikrobiell utnyttelse og langvarig lagring av karbon 5-7. Evnen til å studere strukturelle og metabolske komponenterseparat gir et kraftig nytt verktøy for å fremme forkant av økosystem biogeokjemiske studier. Her beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av 13 C, og 15 N-merket plantemateriale som enten er jevnt merket gjennom hele anlegget eller differensielt merket i strukturelle og metabolske anleggsdeler.
Her presenterer vi bygging og drift av en sammenhengende 13 C og 15 N merking kammer som kan endres for å møte ulike forskningsbehov. Jevnt merket plantemateriale er produsert av sammenhengende merking fra frøplante å høste, mens differensial merking oppnås ved å fjerne de voksende planter fra kammeret uker før innhøsting. Representative resultater fra voksende Andropogon gerardii Kaw demonstrere systemets evne til effektivt etiketten plantemateriale på målrettede nivåer. Gjennom denne metoden har vi produsert plantemateriale med en 4,4 atom% 13 C og 6,7 atom% 15 </ Sup> N uniform plante etikett, eller materiale som er ulikt merket med inntil 1,29 atom% 13 C og 0,56 atom% 15 N i sin metabolske og strukturelle komponenter (varmt vann utvinnbar og varmt vann rest komponenter, henholdsvis). Utfordringene ligger i å opprettholde riktig temperatur, fuktighet, CO 2-konsentrasjon, og lysnivået i en lufttett 13 C-CO 2 atmosfære for vellykket planteproduksjon. Dette kammeret beskrivelse representerer et nyttig forskningsverktøy for å effektivt produsere jevnt eller differentially multi-isotop merket plantemateriale til bruk i eksperimenter på økosystemet biogeokjemiske sykling.
Forstå dynamikken i plante-jord-atmosfære prosesser er avgjørende for nøyaktig forutsi hvordan den globale karbon (C) og nitrogen (N) sykluser funksjon under nåværende og fremtidige miljøforhold. Stabile isotoper er kraftige verktøy i kvantitative studier av plante-jord-atmosfæren C og N sykling. Tracing sjeldne stabile isotoper fra plantemateriale gjennom økosystemet gir sensitiv informasjon i studier av biogeokjemiske sykling, fra CO 2 flussmidler og organisk materiale i jord dannelse til småskala stabil-isotop biomarkør sondering f.eks 4,8,9. Ved å kombinere 13 C merking med 15 N merking, eller andre stabile isotoper som for eksempel 2-H, eller 18 O i plantevev gir en høy-deteksjon, sporbare, men kompleks substrat for bruk ved koblede studier av plante-og jord biokjemi. Evnen til å uniformt eller forskjellig merkelapp strukturelle og metabolsk plantemateriale adds videre evne til å håndtere komplekse spørsmål om C-og N sykling gjennom økosystemer. Fordelen med å bruke isotope merket plantemateriale i kvantitative studier av C-og N regnskap, men er avhengig av evnen til å produsere 13 C, og 15 N-merket materiale som er enten ensartet eller forskjellig merket.
Isotop merking har blitt brukt i studier som omhandler anlegg C og N assimilering 10, tildeling 11 og rhizodeposition 12. Jevnt 13 C og 15 N merket plantemateriale gir en kompleks merket substrat for studier av søppel nedbrytning 1,4, organisk materiale i jord dannelse 2,6, jord CO 2-utslipp 4, jord mat web studerer 13, og studier av jord C oppholdstid 2,14. Studier utnytte 13 C merket biokull fra merket plantemateriale begynner også å avdekke ny informasjon om tidligere oversettjord røye bassenger 15. Mens 15 N, 2 H, og 18 O merking er relativt enkelt å oppnå gjennom behandling vann og gjødsel, finnes utfordringen i å produsere jevnt 13 C merket plantemateriale gjennom 13 C-CO 2 fiksering.
Kontinuerlig isotop merking fra frøplante til forfall i et forseglet kammer gir ensartet isotop merking gjennom hele anlegget. Andre metoder som gjentatte puls merking 16 og bladgjødsling eller fukttransporterende 17,18 ikke produserer jevnt isotop merket plantemateriale, og heller ikke klart differensial merking av spesifikke C-forbindelser (for eksempel stoffskifte vs strukturell) 19. Et viktig hensyn i isotop merking er merking effektivitet, på grunn av den høye kostnaden av sjeldne isotopen anrikede forbindelser som brukes i merking. Selv om kontinuerlig 13 C merking er blitt brukt i det siste 2-4,20, er det ikke til vår kunnskapen publisert detaljert teknisk beskrivelse av en fortløpende merking kammer med tegn på høy merking effektivitet og nøyaktig kontroll av mengde og ensartethet av isotop-merking.
På forkant av kullet nedbrytning og organisk materiale i jord dannelse forskning er konseptet at metabolsk plantemateriale (dvs. utvaskbare, labile, lavmolekylære forbindelser) og strukturell plantemateriale (dvs.. Lignin, cellulose, hemicellulose) behandles ulikt i form av mikrobiell bruke effektivitet, organisk materiale i jord dannelse, og lang sikt jord C lagring 5-7. Plantemateriale, som er differensiert merket i sine strukturelle og metabolske komponenter, derfor er et nyttig verktøy for å fremme kull nedbrytning og organisk materiale i jord dannelse forskning. Differensial merking med to isotoper gir mulighet for sporing av strukturelle og metabolske komponenter separat gjennom økosystemet ved hjelp av en multippel-pool isotopen technique 21.
Kontinuerlig isotop merking med 13 C og andre isotoper i et forseglet kammer krever nøye oppmerksomhet å plante fysiologiske forhold til å maksimere produktiviteten på anlegget og isotop merking effektivitet. Dagtemperatur pigger må reguleres for å hindre planteskade ved dyrking i et lufttett kammer. En optimal spekter av luftfuktighet og temperatur er nødvendig for å opprettholde en åpen plante stomata og CO 2-opptak 22. Høye nivåer av fuktighet årsaken fogging av kammerveggene, noe som minimerer lys tilgjengelighet og kan skade kammerstrukturen. Nøye vurdering isotopseparatorer merking effektivitet ved å eliminere naturlige overflod isotoper fra kammeret (f.eks kommer fra potting med jord organisk materiale) og hindre eksponering for ekstern luft er viktig når du arbeider med dyre heavy-isotop merkede forbindelser.
Her presenterer vi en metode for å bygge og drivekontinuerlig dual 13 C, og 15 N isotop merking kammer for fremstilling av plantemateriale som enten er jevnt merket eller har sin strukturelle og metabolske komponenter merket på forskjellige nivåer. 13C merkingen styres ved kammerets overflate, mens befruktning og 15 N merking er kontrolleres ved den enkelte potten nivå. Representative resultater er vist for å demonstrere evnen som denne fremgangsmåten for å kontrollere temperatur, fuktighet og CO2-konsentrasjon gjennom hele vekstsesongen. Resultater fra voksende Andropogon gerardii, Kaw også demonstrere metodens evne til å produsere jevnt eller differensielt merket plantemateriale. Den spesifikke kammer konstruksjon og drift-ordningen som er beskrevet kan bli modifisert for å dyrke forskjellige plantearter, i tillegg til å imøtekomme 2 H, eller 18 O merking.
Denne utformingen for en kontinuerlig isotop merking kammeret ble brukt til å produsere ensartet og differensielt 13 C, og 15 N er merket A. gerardii for påfølgende felt-og laboratorieforsøk. I løpet av tre vekstsesonger av drift, har kammeret lykkes opprettholdt temperatur, fuktighet og CO 2-konsentrasjoner innenfor de innstilte parametrene (figur 2). Påliteligheten til temperaturkontroll system er kritisk i løpet av midten av sommeren når høy solstråling kan føre til overoppheting i lufttett kammer. Å eliminere overskytende fuktighet som følge av transpirasjon fra de voksende planter sikrer at plantespalteåpningene forblir åpne for fotoopptak 22, og at vannkondensering hemmer ikke lett gjennomtrengning eller skade på strukturen av kammeret.
Den nesten kontinuerlig overvåking av CO 2 konsentrasjonen av Irga programvare vedlikeholdes kontinuerlig13 C merking av plantene, mens de vokste i kammeret. På grunn av den høye fotosyntetiske aktivitet av A. gerardii vokser i denne sal, ble CO 2 injiseres inn i systemet ofte i dagslys timer av peak vekstsesongen når fotosynteseaktiviteten trakk CO 2-konsentrasjoner ned til 360 ppm, omtrent hver 15-20 min. Målingen av anriket og naturlige overflod 13 C-CO-to tanker som er tillatt for en kontrollert 4,4 atom% 13 C atmosfæren gjennom hele vekstsesongen for ensartet plantevev merking. 13. C-CO 2-produksjon kan også oppnås ved å blande 13 C-natrium bikarbonat eller 13 C-natrium-karbonat-og saltsyre, men denne type av system er mer komplisert og krever mer overvåking og vedlikehold, så anbefales anvendelse av 13 C-CO 2-gass. En viktig faktor for å overvåke CO 2 concentrations ved hjelp av en Irga er at infrarøde analysatorer taper to tredeler av deres følsomhet når du måler 13 C-CO 2. Dette undervurdering av om lag 2,9% ppm for våre 4,4% 13 C-CO 2 blanding var ikke av stor bekymring for oss, men kan bli en mer betydelig problem når merking ved høyere 13 C nivå 27.
A. gerardii er en varm årstid flerårig Grass Prairie graminoid arter. Utformingen av dette kammer var optimalisert for A. gerardii produksjon (figur 1). Størrelsen og høyden av kammeret ble valgt av hensyn til maksimal høyde produktiviteten til A. gerardii på feltet, så vel som for den ønskede plantebiomasseproduksjon for fremtidige eksperimenter. A. gerardii er kjent for å være lys begrenset i feltet 24,25. PAR innenfor et drivhus kan bli redusert med 30-47% i forhold til ytre nivåer 26. Siden vårt anleggs ble dyrket i et akrylglass kammer inne i et drivhus, PAR begrensning var en bekymring. Når den er slått på, lysrør økt PAR i kammeret med 9,5%, noe som kan ha bidratt til å øke produktiviteten i denne lette følsomme arter. Når du bruker denne sal design for å vokse andre typer planter spesifikke fysiologiske behov som størrelse, belysning, næringsbehov, temperatur følsomhet, og jordfuktighet bør nøye skreddersydd for å opprettholde optimale vekstforhold for plantene.
Når man arbeider med kostbare isotopisk merkede forbindelser, for eksempel 10 atom% 13 C-CO 2 og 98 atom% 15 N-KNO 3, effektiviteten av merking er en viktig faktor. Dette kammer konstruksjon optimaliserer 13 C merking ved å gjøre alle anstrengelser for å forsegle kammeret og minimere luftlekkasje inn i og ut av kammeret. Hvis dette kammeret er aldri åpnet i vekstsesongen, da ingen av de 13 C etikettened CO 2 fra kammeret er lekket ut til atmosfæren. Den CO 2 bygge opp i løpet av natta åndedrett synes ikke å skade den voksende planter, og er raskt tatt opp etter soloppgang (figur 2). Under differensial merking, ble kammeret kort åpnet for å fjerne differensialt merket potter, men dette synes ikke å fortynne målrettet 4,4 atom% 13 C merking av kontinuerlig merket planter (Tabell 1). 13 C merking ble også optimalisert ved å skrubbe ut innledende atmosfærisk luft fanget i kammeret ved tetting. Under foreløpige tester på kammeret uten en innledende skrubb av atmosfærisk CO 2, ble plantene målt til å ha en fortynnet 13 C-nivå i de første bladene produsert enn i de senere bladene produsert. Den innledende skrubb av atmosfærisk CO 2 på kammeret nedleggelse ser ut til å eliminere dette problemet ved å tillate for kontinuerlig 13 C merking frafrøplante til forfall. Opprettholde et jord-fri potting blanding av sand, vermikulitt, og leire eliminerer også naturlig overflod CO 2 forurensning fra jord åndedrett. Elimineringen av jord fra systemet krever forsiktig befruktning og inokulasjon betraktninger, som kan være unike for forskjellige plantearter. 15. N merking gjennom målrettet 7 atom% 15 N Hoegland løsning fremstilt sterkt merket plantemateriale til 6,7 atom% 15 N (tabell 1). En svak fortynning fra det målrettede 15 N etiketten kan være forårsaket av noen naturlige overflod N i potting blanding eller fra det stedlige masser inokulasjon.
Under biosyntesen av forbindelsene, forekommer naturlig diskriminering av 13 C (eller 15 N) som følge av kinetisk fraksjonering og nonstatistical isotop fordeling i de syntetiserte forbindelser. Således, i tilfelle av C, sekundære produkter (for eksempel lipider, av fenol-forbindelser) er generelt utarmet på 13 C, sammenlignet med primære produkter (karbohydrater). Denne naturlige 13 C diskriminering synes å vedvare også når plantene dyrkes i en anriket 13 C atmosfæren, som kan sees i det liten forskjell i atom% 13 C av de varme vannekstrakter og varmt vann rester av de uniformt merkede planter (tabell 1 ). Denne naturlige bevegelsesfraksjonering er meget liten i forhold til berikelse og forringer ikke jevnheten av merking.
Differensial merking av strukturelle og metabolske plantemateriale er en ny metode med potensial for videre studier i kullet nedbryting, mikrobiell økologi og organisk materiale i jord formasjon. Forskjellen i 13 C og 15 N for varmt vann ekstrakter og varmt vann rester indikerer en betydelig fortynning av 13 C, og 15 N i utvaskbare, lavmolekylvekt-forbindelser (varmtvann utdrag) fra den strukturelle plantemateriale (varmtvann rester) etter 7, 14 og 22 dager etter differensial merking (P <0.005). Denne differensial merking av plantevev kan anvendes for å spore skjebnen til strukturelle og metabolske komponenter hver for seg gjennom et økosystem. Den 13 C differensial merking var mer ekstrem enn 15 N differensial merking. Dette kan være på grunn av umiddelbarhet av 13 C fortynning når du fjerner plantene fra 13 C-CO 2 merket atmosfære, mens 15 N etiketten gjenstår fortsatt i potting mix for noen tid, og 15 N fortynning skjer saktere. For mer drastiske differensial merking av 15 N, kan man vurdere å skylle pottene med vann før naturlig overflod befruktning i løpet av de siste ukene av vekst utenfor kammeret.
Utforming og drift av denne kontinuerlige 13 </ Sup> C og 15 N merkesystem for ensartet eller differensial, metabolske og strukturelle, plantevev merking tilveiebringer en ny fremgangsmåte for fremstilling av isotopisk merket plantemateriale for avansert forskning. Utformingen og operasjonelle detaljer av dette kammeret har blitt valgt for 4,4 atom% 13 C og 7 atom% 15 N merking av A. gerardii, men kan skreddersys til andre plantetyper og isotop merking nivåer. Vekstforhold som er beskrevet her bør tilpasses for å passe størrelse, temperatur, luftfuktighet, lys, vann og næringsstoffer krav til spesielle plantearter av interesse. Merking med 18 O-eller 2 H kan også oppnås ved å merke det vann som brukes i vanningssystem. Systemet er beskrevet her tar for mange av utfordringene i uniform og forskjells 13 C merking av plantemateriale. Denne grunnleggende kammer design kan brukes av andre forskningsmiljøer til å produsere svært merket plantemateriale for advanced studier i økosystemet biogeokjemi.
The authors have nothing to disclose.
Spesiell takk til Plant Growth Facility og EcoCore analytisk anlegg ved Colorado State University og til de mange elever og lærere som hjalp på dette prosjektet. Dette arbeidet er finansiert av NSF DEB stipend # 0918482, USDA National Needs Fellowship, og Cotrufo-Hoppess fond for jord økologi forskning.
40 in Remote Tower Fan | Living Accents | FS10-S3R-A | |
42 in Electric Tower Fan with remote control | LASKO | 2559 | |
Mr. Slim Split-type air conditioner | Mitsubishi Electric | R410A | |
Electronic 24 hr time switches | Intermatic | ET100C | Operates Fluorescent Light System |
iSeries Humidity and Temp Controller | Omega | CHiTH-i8DV33-5-El | |
Solid State Relay | Omega | SSRL240 | |
CKR Series Solid State Relay | Crydon | ||
Solenoid Coils | Dayton | 6X543 | |
GasHound CO2 Analyzer | LI-COR | LI-800 | |
Dehumidifier | Dayton | 1DGX4 | |
Specialty gas regulator | Airgas | CGA 580 | |
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System | Hydro Farm | FLT48 | |
Air pump | Thermo Scientific | 420-1901 | |
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem | Cole Parmer | 7553-70 | |
1900 Series Network Switch | Catalyst | ||
Profile Porus Ceramic Top Dressing | Greens Grade | ||
Industrial Quartz 40 mesh | Unimin | 4095 | |
Mycorrhizae Professional Growing Medium | ProMix | ||
Vermiculite and Perlite | Thermo-Ran | C633 | |
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % | Sigma-Aldrich | 335134 | |
Carbon-13C Dioxide 10 atom % | Sigma-Aldrich | 600180 | |
Medical grade CO2 | Airgas | ||
Regulator | Airgas | CGA 350 | |
4 in box fans | Grainger | ||
Masterflex PharMed BPT Tubing | Cole Parmer | HV-06508-24 |