Brug fluorescerende proteiner til at visualisere og kvantificere<em> Chlamydia</em> Vakuole Vækst Dynamics i levende celler

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

Smitsomme sygdomme forårsaget af arter af den intracellulære bakterie Chlamydia fremkalde en større byrde på global sundhed, herunder seksuelt overført sygdom, underlivsbetændelse, blindhed, lungebetændelse og muligvis åreforkalkning ^1-4. Evnen af Chlamydia at interagere med værtscellen, fra et vacuole (betegnet optagelse), er en kritisk determinant for en vellykket infektion af celler og værten. Medtagelsen er et nyt patogen rum, der muliggør chlamydia vækst og er dynamisk modificeret hele 2-3 dages udviklingsmæssige cyklus af Chlamydia ^5. Den obligat intracellulære natur chlamydiae præsenterer en lang række udfordringer for forskningsverdenen, navnlig for direkte at studere den unikke biologi integration. En større handicap har været den manglende evne til effektivt at visualisere enten intracellulært Chlamydia eller deres optagelse ved fluorescerende tilganges i levende celler. En nylig opdagelse har endelig afsløret de midler til GFP udtrykke C. trachomatis ^6; Men dette resultat har endnu ikke ført til særlig mærkning af optagelsen. Nogle teknikker er blevet beskrevet til mærkning af bakterier og inklusioner ^7,8, men de lider af mangler, såsom ikke-specifikke, transiency og tilbøjelighed til fotoblegning. En vigtig opdagelse, som vores gruppe etableret en ny strategi til belysning af optagelsen ved hjælp af GFP udtrykkende værtsceller ^9. Denne strategi rationelt udnytter den iboende uigennemtrængelighed for optagelse membran til molekyler større end 520 Da ^10. Når celler er konstrueret til stabilt udtrykker et bestemt cytosolisk fluorescerende protein (f.eks GFP eller mCherry), Chlamydia inklusioner er synlige med bemærkelsesværdig klarhed ved deres fuldstændige udelukkelse af fluorescens. Denne omvendte imaging strategi gør det muligt omgående visualisering af inklusioner for alle Chlamydia arter, og det kan let tilpasses til de fleste værtceller af interesse. Som en demonstration af sin nytte, blev denne metode anvendt tidligere til at afsløre og definere de cellulære exit veje for Chlamydia spp ^9.

Her har vi demonstrerer endvidere, hvorledes denne metode udføres, og kan udnyttes til at udlede vigtige kvantitative data om vækst integration dynamik. Endvidere kan det effektivt erstatte dyre antistofbaserede tælling metoder og kan anvendes sammen med andre fluorescerende mærker, såsom mKate2-udtrykkende Chlamydia ^11. Denne kraftfulde kombination af værktøjer muliggør udforskning af de fysiske egenskaber af chlamydia integration membran inde levende værtsceller.

Protocol

1. Generation of Fluorescent Host Cell Lines Day 1. Plate 293T cells (or other retroviral packaging line) on 6-well plates at 2 x 106 cells/well, to be ~75% confluent the next day. If desired, plate duplicate wells for each retrovirus to be used. Day 2. Aspirate cells and add 2 ml fresh growth medium (DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine). Transfect cells with 5–8 µg each of retroviral vector (containing GFP) and packaging vector (e.g., pVSVg) using Lipofectamine 2000 or …

Representative Results

Mammalian cells expressing cytosolic fluorescent proteins (e.g., GFP) can be engineered to enable illumination of Chlamydia inclusions in live, infected cell cultures. Upon infection with Chlamydia, inclusions are readily visible as black spots in the host cells (Figure 1). The clarity of fluorescence-lacking inclusions can be exploited for the automated identification of inclusions across numerous fields of view and/or treatments (Figure 1). Once fluorescent h…

Discussion

Here we describe the experimental strategy for generating fluorescent host cells for real time visualization and analysis of Chlamydia inclusions. This vacuole visualization approach confers the powerful ability to illuminate, track and quantitatively measure the dynamic properties of chlamydial inclusions across populations of cells or in single cells over time. Chlamydia inclusions in fluorescent protein labeled cells are strikingly well defined, such that they are easily identified without the need f…

Materials

Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534