Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em> Chlamydia</em> Vacuole groeidynamiek in levende cellen
Summary
A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
Abstract
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
Introduction
Infectieziekten veroorzaakt door species van de intracellulaire bacterie Chlamydia wekken grote belasting voor wereldwijde gezondheid, waaronder seksueel overgebrachte ziekte, eileiderontsteking, blindheid, longontsteking en eventueel atherosclerose 1-4. Het vermogen van Chlamydia om met de gastheercel, vanuit een vacuole (genaamd de opname), is een bepalende factor voor hun succesvolle infectie van cellen en de gastheer. De opname is een nieuwe pathogene compartiment dat chlamydia groei mogelijk maakt en wordt dynamisch aangepast gedurende de hele 2-3 dag ontwikkelings cyclus van Chlamydia 5. De obligate intracellulaire aard van chlamydiae presenteert talrijke uitdagingen voor de onderzoeksgemeenschap, in het bijzonder voor het direct bestuderen van de unieke biologie van de integratie. Een grote handicap is het onvermogen om efficiënt te visualiseren ofwel intracellulaire Chlamydia of hun opname door TL-aanpakes in levende cellen. Een recente ontdekking heeft eindelijk onthuld de middelen om GFP tot expressie C. genereren trachomatis 6; echter, is deze bevinding nog niet geleid tot de specifieke kenmerken van de integratie. Sommige technieken zijn beschreven voor labeling van bacteriën en insluitsels 7,8, maar ze vertonen tekortkomingen zoals niet-specificiteit, vergankelijkheid en gevoeligheid voor fotobleken. Een belangrijke ontdekking door onze groep werd een nieuwe strategie voor het verlichten van de opname met behulp van GFP tot expressie gastheercellen 9. Deze strategie rationeel exploiteert de intrinsieke ondoordringbaarheid van de opname membraan moleculen groter dan 520 Da 10. Wanneer cellen worden gemanipuleerd om stabiel drukken een bepaald cytosolische fluorescent eiwit (bijvoorbeeld GFP of mCherry), Chlamydia insluitsels zichtbaar met opmerkelijk heldere hun volledige uitsluiting van fluorescentie. Deze omgekeerde beeldvorming strategie maakt directe visualisatie van insluitsels voor alle Chlamydia species en kan gemakkelijk worden aangepast voor de meeste gastheercellen van belang. Als een demonstratie van het nut ervan, werd deze methode eerder gebruikt te onthullen en te definiëren de cellulaire exit routes voor Chlamydia spp 9.
Hier hebben we verder aan te tonen hoe deze methode wordt uitgevoerd, en kan worden benut om belangrijke kwantitatieve gegevens over de groei inclusie dynamiek ontlenen. Bovendien kan het effectief vervangen dure antilichamen gebaseerde inventarisatie werkwijzen en kan worden gebruikt in combinatie met andere fluorescente labels, zoals mKate2-expressie Chlamydia 11. Deze krachtige combinatie van instrumenten mogelijk maakt onderzoek van de fysische eigenschappen van de chlamydiale membraan integratie binnen levende gastheercellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we de experimentele strategie voor het genereren van fluorescente gastheercellen voor real time visualisatie en analyse van Chlamydia inclusies. Deze vacuole visualisatie benadering verleent het krachtige vermogen te verlichten, volgen en kwantitatief meten van de dynamische eigenschappen van Chlamydia inclusies tussen populaties van cellen of enkele cellen in de tijd. Chlamydia inclusies in fluorescent eiwit gelabelde cellen opvallend goed gedefinieerd, zodat ze gemakkelijk geïdentif…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
Riferimenti
- Stamm, W. E. Chlamydia trachomatis infections: progress and problems. The Journal of Infectious Diseases. 179, S380-S383 (1999).
- Schachter, J., Stephens, R. S. Infection and disease epidemiology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 139-169 (1999).
- Campbell, L. A., Kuo, C. C. Chlamydia pneumoniae–an infectious risk factor for atherosclerosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (1), 23-32 (2004).
- Darville, T., Hiltke, T. J. Pathogenesis of genital tract disease due to Chlamydia trachomatis. The Journal of Infectious Diseases. 201, S114-S125 (2010).
- Hackstadt, T., Stephens, R. S. Cell biology. Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. , 101-138 (1999).
- Wang, Y., Kahane, S., Cutcliffe, L. T., Skilton, R. J., Lambden, P. R., Clarke, I. N. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector). PLoS Pathogens. 7 (9), e1002258 (2011).
- Hackstadt, T., Scidmore, M. A., Rockey, D. D. Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
- Boleti, H., Ojcius, D. M., Dautry-Varsat, A. Fluorescent labelling of intracellular bacteria in living host cells. Journal of Microbiological Methods. 40 (3), 265-274 (2000).
- Hybiske, K., Stephens, R. S. Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11430-11435 (2007).
- Heinzen, R. A., Hackstadt, T. The Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuolar membrane is not passively permeable to low-molecular-weight compounds. Infection and Immunity. 65 (3), 1088-1094 (1997).
- Wickstrum, J., Sammons, L. R., Restivo, K. N., Hefty, P. S. Conditional gene expression in Chlamydia trachomatis using the tet system. PLoS One. 8 (10), 10-1371 (2013).
- Chin, E., Kirker, K., Zuck, M., James, G., Hybiske, K. Actin recruitment to the Chlamydia inclusion is spatiotemporally regulated by a mechanism that requires host and bacterial factors. PLoS One. 7 (10), e46949 (2012).
- Agaisse, H., Derré, I. A C. trachomatis cloning vector and the generation of C. trachomatis strains expressing fluorescent proteins under the control of a C. trachomatis promoter. PLoS One. 8 (2), e57090 (2013).
