Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em> Chlamydia</em> Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas
Summary
A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.
Abstract
The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.
Introduction
Doenças infecciosas causadas por espécies da bactéria intracelular Chlamydia provocar um grande fardo para a saúde global, incluindo doença sexualmente transmissível, doença inflamatória pélvica, cegueira, pneumonia e possivelmente aterosclerose 1-4. A capacidade de Chlamydia para interagir com a célula hospedeira, a partir de dentro de um vacúolo (denominado a inclusão), constitui um factor determinante para a sua infecção bem sucedida de células e o hospedeiro. A inclusão de um compartimento é patogénico romance que permite o crescimento e clamídia é dinamicamente modificada ao longo de todo o ciclo de desenvolvimento de 2-3 dias de Chlamydia 5. A natureza intracelular obrigatório de clamídias apresenta inúmeros desafios para a comunidade de pesquisa, em especial para estudar diretamente a biologia única da inclusão. A grande desvantagem tem sido a incapacidade de visualizar de forma eficiente, quer intracelular Chlamydia ou a sua inclusão pela abordagem fluorescentees em células vivas. Uma descoberta recente revelou finalmente os meios de produção de GFP expressando C. trachomatis 6; no entanto, esta constatação não conduziu ainda a rotulagem específica da inclusão. Algumas técnicas têm sido descritas para a rotulagem de bactérias e inclusões de 7,8, mas eles sofrem de deficiências, como a não-especificidade, transitoriedade e susceptibilidade à fotodegradação. Uma descoberta chave do nosso grupo estabeleceu uma nova estratégia para iluminar a inclusão usando GFP expressando células hospedeiras 9. Esta estratégia explora a impermeabilidade racionalmente intrínseca da membrana inclusão a moléculas maiores do que 520 Da 10. Quando as células são manipuladas para expressar estavelmente uma proteína fluorescente cytosolic particular (por exemplo, ou GFP mCherry), inclusões de clamídia são visíveis com uma nitidez notável por sua exclusão completa de fluorescência. Esta estratégia de imagem inversa permite a visualização imediata das inclusões para todos Chlespécies amydia e pode ser facilmente adaptado para a maioria das células hospedeiras de interesse. Como uma demonstração da sua utilidade, este método foi utilizado anteriormente para revelar e definir as vias celulares de saída para Chlamydia spp 9.
Aqui, nós ainda demonstrar como esse método é realizado, e pode ser explorado para obter dados quantitativos chave sobre dinâmica de crescimento inclusão. Além disso, pode substituir de forma eficaz para a enumeração métodos baseados em anticorpos dispendiosos e pode ser usado em conjunto com outros marcadores fluorescentes, tais como mKate2-11 expressando Chlamydia. Esta poderosa combinação de ferramentas permite a exploração das propriedades físicas da membrana de clamídia inclusão dentro das células hospedeiras de estar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós descrevemos a estratégia experimental para a geração de células hospedeiras fluorescentes para visualização em tempo real e análise de inclusões de clamídia. Esta abordagem visualização vacúolo confere a poderosa capacidade de iluminar, controlar e medir quantitativamente as propriedades dinâmicas de inclusões por clamídia entre as populações de células ou em células isoladas ao longo do tempo. Inclusões de clamídia em células proteína marcada fluorescentes são notavel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Ian Clarke and P. Scott Hefty for the pGFP-SW2 and pASK-GFP-mKate2-L2 plasmids, respectively. We thank Paul Miller for technical assistance and Richard Stephens for other resources. This work was funded by NIH grant AI095603 (KH).
Materials
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene | Sigma | H9268 | |
| 0.45 µm filters | Fisher | 09-719D | |
| G418 | Invitrogen | 10131 | |
| HBSS | Invitrogen | 14025 | |
| DMEM | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | |
| RPMI 1640 w/o phenol red | Cellgro | 17-105-CV | |
| Penicillin G | Sigma | 13752 | |
| Cycloheximide | Sigma | C7698 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Chamber slides, Lab-Tek II | Nunc | 154526, 154534 |
Riferimenti
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