Neisseria meningitidis er en human specifikke patogen der inficerer blodkar. I denne protokol indføres menneskelige mikrokar i en mus ved podning menneskehud på immunkompromitterede mus. Bakterier overholde udstrakt grad til de menneskelige fartøjer, hvilket fører til vaskulær skade og udvikling af purpuric udslæt typisk observeret i humane tilfælde.
Neisseria meningitidis forårsager en alvorlig, ofte dødelig sepsis, når det kommer ind i humant blod stream. Infektion fører til omfattende beskadigelse af blodkar, hvilket resulterer i vaskulær lækage, udvikling af purpuric udslæt og eventuel vævsnekrose. Studer patogenesen af denne infektion var tidligere begrænset af den menneskelige specificitet af bakterierne, hvilket gør in vivo modeller vanskelig. I denne protokol, beskriver vi en humaniseret model for denne infektion, hvor den menneskelige hud, der indeholder dermale mikrokar, podes på immunsvækkede mus. Disse skibe anastomoserer med musen cirkulation og samtidig bevare deres menneskelige egenskaber. Når indført i denne model, N. meningitidis overholde udelukkende de menneskelige fartøjer, hvilket resulterer i omfattende vaskulær skade, inflammation og i nogle tilfælde udvikling af purpuric udslæt. Denne protokol beskriver podning, infektion og evaluering trin i denne model i Context af N. meningitidis infektion. Teknikken kan anvendes til en lang række specifikke humane patogener, der inficerer blodet.
Meningokok sepsis er en ofte dødelig blod født infektioner forårsaget af bakterielt patogen Neisseria meningitidis. Meningokok sepsis patienter ofte til stede med en petekkier eller purpuric udslæt på deres hud, som tidligere har været forbundet med vaskulære ødelæggelser forårsaget af cirkulerende bakterier og bakterielle produkter 1. Hudbiopsier fra kliniske patienter viser bakterier forbundet med mikrokar ofte fylde beholderne 2. Bortset fra bakterier, omfattende trombose, koagulation, overbelastning og vaskulær lækage ses i purpuric regioner 3-5. Denne vaskulær skade kan føre til omfattende nekrose af huden og det omgivende væv, hvilket resulterer i débridement og endda amputation i meningokok overlevende. Forstå, hvordan infektion forårsager denne vaskulær skade er vigtigt at optimere forebyggelse og behandling strategier. Hovedparten af forskningen i meningokok sepsis er blevet udført in vitro påhumane cellelinier på grund af den menneskelige specificitet N. meningitidis. Mange aspekter af infektion er blevet undersøgt in vitro, herunder bakteriel adhæsion, værtscelle respons samt cytokin respons 6-9. Type IV pili (TFP) har været impliceret som den store friktion organel til N. meningitidis på begge epitel og endotelceller 10. Det er også blevet påvist, at adhæsion af N. meningitidis til værtsceller er forskydningsspænding afhængig og derfor menes at være relateret til blod flow i mikrovaskulaturen 11. Dette tyder dynamiske belastninger bakterierne står in vivo er afgørende for patogenese. Det er imidlertid meget vanskeligt at modellere mikromiljø små fartøjer in vitro.
Vedhæftningen receptor for Neisseria TFP er stadig ukendt, og derfor ikke kan sendes knock-i strategier for at opnå bakteriel adhæsion i en dyremodel på dette tidspunkt. CD46 blev foreslået at være TFP-receptoren og transgene dyr blev fremstillet til at fungere som musemodeller. Men infektion i disse dyr ikke føre til omfattende infektion eller udslæt udvikling 12,13. Andre dyremodeller, der er blevet beskrevet for bakteriæmi aspekt af Neisseria-infektion tage hensyn til den bakterielle præference for human transferrin som en jernkilde 14,15. Enten supplere human transferrin eller udtrykker det fra et transgen resulterer i en øget bakteriel belastning i blodet over en længere periode, men denne model viser ingen bakteriel adhæsion eller udslæt udvikling 16,17.
I denne protokol, beskriver vi en humaniseret musemodel, hvor den menneskelige hud, herunder dermal microvasculature er transplanteret på immunsvækkede mus 18,19. Dette resulterer i funktionelle menneskelige skibe perfused med musen cirkulation. Kombineret med den menneskelige transferrin tilskud, denne model tegner sig for mindst to af de menneskelige specifikke aspekter af N. meningitidis, dvs humant endotel og human transferrin i et in vivo miljø. N. meningitidis indført intravenøst i denne model klæbe specifikt til humant endotel, der producerer en patologi, der svarer til hvad der er rapporteret i kliniske patienter, herunder vaskulær skade og purpuric udslæt udvikling 18.
Dyremodeller er kritisk vigtigt at bakteriel patogenese forskning. Det er umuligt fuldstændigt at efterligne in vivo-miljøet i cellekultur, og det bliver tydeligt, at værtspatogene interaktionen påvirkes af mange dynamiske faktorer. Den menneskelige specificitet nogle klinisk vigtige patogener, såsom N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes og Salmonella typhi har begrænset anvendelsen af in vivo-modeller for disse infektioner. Men når vi begynder at forstå, hvilke smitsomme skridt er involveret i specificitet humaniserede modeller er under udvikling. Protokollen beskrevet her er en demonstration af dette med indførelsen af humane mikrokar i mus, der giver mulighed for omfattende in vivo-infektion med N. meningitidis, hvilket resulterer i vaskulær skade og lejlighedsvis udvikle purpuric udslæt.
Anvendelse af denne modelvi har været i stand til at definere, at klæbeevne TFP er involveret i vaskulær kolonisering in vivo ved hjælp af bakterielle mutanter, og at den vaskulære skade reduceres i fraværet af friktion 18. Tidligere har cirkulerende bakterielle produkter været impliceret i denne skade, men vores resultater tyder på en afgørende rolle for den lokale vedhæftning og vaskulær kolonisering. Det åbner nye muligheder for udvikling af nye behandlingsmål. Hvis vedhæftning af sygdomsfremkaldende bakterier kan blive blokeret farmaceutisk det kunne muligvis forebygge udviklingen af hudlæsioner og føre til bedre resultater for meningokok overlevende i form af vævsnekrose, débridement og amputationer. Arbejdet har også vist kompleksiteten af infektionen og inddragelse af immunresponset og koagulationskaskaden den. Vi identificerede menneskelige cytokin signalering i serum fra inficerede mus på trods af den relativt lille mængde humant endotel nuværende 18 år.Dette indikerede en signifikant cytokin respons sammen med infiltration af muse immun cellepopulationer ind i området.
Dyremodeller kan selvfølgelig aldrig helt replikere sygdom hos mennesker og alle resultater fået fra dem, skal betragtes med dette i tankerne. For eksempel, i denne model blodet og cirkulerende celler er af museoprindelse, og vi kan ikke rabat, at de kan opføre sig anderledes til humane celler. En fordel ved dette er imidlertid, som vist i vores nylige publikation 18, er evnen til at skelne signaler stammer fra den humane endotel fra de cirkulerende museceller. Den immunkompromitterede baggrund af de anvendte mus i denne model vil også give mulighed for allogen overførsel af humane immun cellepopulationer, tilføjer endnu en "humanisering" aspekt. Immunkompromitterede baggrund af musene kan dog maskere en rolle for NK, T-eller B-celler, som alle mangler eller defekte i denne model. Den relativt Short tidsramme (24 timer), der anvendes i denne model først og fremmest drejer sig om den medfødte respons, men for langsigtede infektioner og udvikling af immunitets andre muligheder kan være nødvendigt at blive udforsket.
Huden er en vigtig infektion site for N. meningitidis men har en relativt lille mængde af menneskelige skibe betyder også, at ekstrapolere data til en systemisk infektion involverer mange organer er vanskelig. Mens denne model giver mulighed for studiet af dermal læsion udvikling, vigtige skridt for meningokok infektion såsom epitelial og blod-hjerne-passage ikke inkluderet. Videreudvikling af disse humaniserede modeller er nødvendig for at løse disse andre aspekter af infektionen. Ikke desto mindre er denne model tilbyder et stort potentiale for mange specifikke humane patogener, især rettet mod blodkarrene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af Dumenil lab, især Silke Silva for kritisk læsning af manuskriptet. Den kirurgiske afdeling på Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin og Dr. Patrick Bruneval, Pathology Department på HEGP. Dyret facilitet på PARCC, ledet af Elizabeth Huc. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud agenturer: Marie Curie IEF stipendium nej. 273.223 (KM), ATIP-Avenir Grant fra INSERM, CODDIM udstyr tilskud (Ile de France-regionen), FRM (Fondation pour la recherche médicale) udstyr tilskud, den IBEID Laboratory of excellence konsortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) tilskud " Bugs-i-flow ". De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og-analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.
DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
(Rompun 2%) | |||
Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
Lacrigel | |||
Tronothane | Lisa Pharma | ||
GC agar Base | Conda | 1106 | |
Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
OCT tissue tek | Sakura | 4583 |