מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז'רמינל

Summary

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

Abstract

ניטור תקשורת סלולרית על ידי מיקרוסקופית רב פוטון רקמות עמוקות intravital הוא המפתח להבנת גורלם של תאי מערכת החיסון בתוך דגימות עבות רקמות ואיברים בבריאות ובחוליים. על ידי שליטה על תבנית הסריקה במיקרוסקופ רב פוטון ויישום אלגוריתמים מספריים מתאימים, פיתחנו גישת פסי תאורה, מה שאיפשר לנו להשיג פי 3 ברזולוציה צירית טוב יותר ויחס משופר אות לרעש, כלומר לעומת זאת, בלמעלה מ 100 עומק רקמת מיקרומטר בתוך מאוד פיזור רקמות של איברים הלימפה בהשוואה למיקרוסקופיה רב פוטון סטנדרטי. מהירות הרכישה, כמו גם השפעות photobleaching וניזקים היו דומה לטכניקת צילום המבוסס על מכפיל סטנדרטי, ואילו עומק ההדמיה היה מעט נמוך יותר בשל השימוש בגלאי שדה. על ידי שימוש בגישה עם פסי התאורה, אנו מסוגלים להתבונן בדינמיקה של פיקדונות מורכבים חיסון בתאים דנדריטים זקיקים משניים ̵1; ברמה של כמה מולקולות חלבון במרכזים נבטי.

Introduction

מיקרוסקופ לייזר סריקת שני פוטונים (TPLSM), עם יתרונות משלה להדמית רקמות עמוקות הקשורות לעירור פעם אולטרה קצר אינפרא אדום ^1, יש מהפכה השקפתנו על תהליכים חיוניים ברמה תא בודד על ידי חשיפת דפוסי תנועתיות ואינטראקציה של שונים תת תא חי חיות ^2-5. עם זאת, טכנולוגיה נוכחית היא עדיין לא מספיק כדי להבהיר את מנגנוני פעילות של איברים שונים ותפקוד כתנאי מוקדם לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, שכן הוא הופך את המידע דליל רק על הבסיס המולקולרי של תגובה תאית בתוך רקמות בבריאות ובחוליים. הטכנולוגיה נוכחית מאפשרת חלון מרחבית רק של כמה מאה מיקרונים בשל פיזור ולנופף באפקטי עיוות קדמיות ברזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש ^6, שהן בולטות במיוחד ברקמה הקומפקטית ביותר של בעלי חיים מבוגרים. השפעות עיוות אלו פיזור ולנופף מולם בשל הטרוגנית מאודחלוקת ד איזוטרופי של מקדם השבירה ברקמות, מה שמוביל בשלב ראשון להידרדרות תלויה עומק של רזולוציה מרחבית 3D וסופו של דבר לאובדן המוחלט של אותות שמקורם פוטונים עירור בליסטיים, כלומר הפסד של יחס אות לרעש. במונחים של bioscientific ויישומי רקמות עמוקות ביו, זה אומר שהטכנולוגיה הנוכחית אינה מסוגלת לחשוף את התקשורת סלולרית באופן חד משמעי, כי ברזולוציה נמוכה תוביל לאינטראקציות באופן כוזב חיוביות ואילו הירידה של יחס אות לרעש הייתי לגרום למערכת להתעלם מכמה יחסי גומלין בין מבנים עמומים.

על מנת לזהות באופן חד משמעי אינטראקציות הסלולר באופן דינמי, יש צורך ברזולוציה מרחבית השתפרה מאוד עמוק בתוך הרקמה. טכניקות Nanoscopy החזקות הציגו כיום מבוססות על אלגוריתמים מיוחדים מספריים, למשל גישות מבנה תאורה, על דלדול של המצב המעורר הראשון, כגון </em> STED, RESOLFT, או על לוקליזציה מולקולה, למשל dSTORM, PALM, מצאו יישומים רבים בתאים קבועים, כמו גם בתרביות תאים חיות ^7. עם זאת, על מנת להרחיב את היישומים הללו לסעיפי רקמות, רקמות ואורגניזמים חיים שעדיין צריכים להתגבר על קשיים טכניים חמורים. שני פוטונים עירור STED עם אורכי גל שונים, כמו גם עם אורך גל יחיד (sw2PE-STED) לעירור ופליטה מאולץ יושמה כדי לשפר את הרזולוציה לרוחב פרוסות מוח ⁸ או במטריצות מלאכותיות עם תאים מוטבעים ^9, בהתאמה, באותו רזולוציה צירית כTPLSM סטנדרטי. שימוש אחד הפוטון STED, הדינמיקה של קוצים הדנדריטים יכולה להיות צילמה על פני השטח של קליפת המוח (עד 10-15 עומק מיקרומטר) בעכבר Thy1 EGFP מתגורר ברזולוציה של 67 ¹⁰ ננומטר. כלי תכליתי לביולוגיה התפתחותית מסופק על ידי מיקרוסקופ מובנה תאורה multifocal, המספק 2D הכפול השתפררזולוציה. עם זאת, טכניקה זו ניתן להשתמש רק באורגניזמים עם נטייה נמוכה של פיזור אור, כגון עוברי דגי זברה ^11. ובכל זאת, אף אחת מהטכניקות הללו ניתן ליישם ברקמת הפערים הפיזור של בעלי חיים מבוגרים בכמה מאות מיקרומטרים, שהם מודלים חיוניים למחקר ביו והקליני של מחלות עם הופעה לאחר לידה.

מבקר של הקירוב משמש לחישוב את צורת חזית גל העקיפה מוגבל, כלומר פונקצית נקודת התפשטות (כוחות הביטחון הפלסטיניים), לאחר ההתמקדות דרך עדשה, הרוחב של כוחות הביטחון הפלסטיניים לאורך הציר האופטי (ברזולוציה צירית) הוא לפחות פי שלוש גדול יותר רוחב כוחות הביטחון הפלסטיניים בניצב לציר האופטי (ברזולוציה רוחב) ^12. לנופף עיוותים מול הזמנות שונות לכמת ידי המקדמים של Zernike משמעותי לשנות את צורת חזית הגל של גל אלקטרומגנטים ממוקד בתחום ההדמיה רקמות עמוקות שמוביל לPSFs הרבה יותר גדול, במיוחד לאורך אופטיאל ציר ^13-15. לפיכך, שני החוקים העקיפה והשפעות עיוות חזית הגל מצביעים על הרזולוציה לאורך הציר האופטי כגורם המגביל בהדמיה רקמות עמוקות. ואילו טכניקות Nanoscopy להתמקד במנטרלות את המגבלות של השתברות, טכנולוגיה שמשפרת את הרזולוציה וחדות על ידי מנטרל הן עקיפה ואפקטי עיוות גל קדמי צירית יש צורך רק להדמית intravital ברזולוציה גבוהה. באופן אידיאלי, טכניקה זו צריכה להיות גם מהיר מספיק כדי לאפשר ניטור של דינמיקה סלולרית.

תיקון סטיות כוחות הביטחון הפלסטיניים ואובדן ניגוד באמצעות האופטיקה מתקנת בTPLSM בזמן אמת, נחקר בהרחבה והשתפר בעשור האחרון ^13,14,16-18 ולכן הבחירה הטובה ביותר הזמינים כיום המובילה לניהול טוב יותר של עירור בליסטי פוטונים ^14. ובכל זאת, בשל העובדה שרוב לנופף מול תיקון גישות בשימוש באופטיקה אדפטיבית הם איטרטיבי וכי הם חהיש צורך לחזור לאזורים קטנים (כמה 10 x 10 מיקרומטר ²⁾ בשל ההטרוגניות הגבוהה של מקדם השבירה ברקמות, מהירות הרכישה היא נמוכה באופן משמעותי מהנדרש לתנועתיות תא הדמיה ותקשורת. יתר על כן, המגבלה הפיסית בהסתגלות אופטיקה השתפרה TPLSM עדיין נקבעת על ידי עקיפה.

אפנון המרחבי של תאורה (SPIN) ואפנון זמני בצד זיהוי (ספייד) הוצעו באופן תיאורטי שיחול על מיקרוסקופיה לייזר סריקה כדי לשפר את הרזולוציה. היישום המעשי שלהם בתחום ההדמיה intravital עדיין להיות הפגין ^19.

יחדיו, יש ביקוש גבוה לפיתוח של טכנולוגיות, המשפרות את הרזולוציה להדמית רקמות עמוקות בחיים בעלי חיים מבוגרים. בעבודה זו, אנו משיגים אפנון המרחבית של דפוס העירור על ידי שליטה על תהליך הסריקה ברב קרן לייזר-s רב פוטון עם פסי תאורהמיקרוסקופיה שימורים (MB-SI-MPLSM) ^20. בניגוד לגישות תאורה מובנה, שבו חתך קורה עירור הוא מווסת מרחבית, אנו משתמשים רק בתהליך הסריקה על מנת להשיג את האפנון המרחבי של העירור. על ידי הרחבת העירור לאורך גל ארוך יותר, אנו מסוגלים לשפר את שניהם ברזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש ברקמות עמוקות של מאוד פיזור רקמות (בלוטות לימפה לדוגמא, נתיב חופשי פיזור 47 מיקרומטר ^6), ללא תלות באופטית אות שאינו ליניארי אנו מזהים, כגון הקרינה, דור שני הרמוני או בתדירות אחרת ערבוב תופעה. שימוש בגישה זו באורכי גל עירור עד 900 ננומטר אנו מסוגלים באופן דינמי מבנים חלבוניים סלולריים תמונה בקנה המידה של כמה מולקולות במרכזים נבטי של בלוטות לימפה בעכבר. לפיכך, אנו יכולים לחזות טובים יותר את האינטראקציה בין יחידות אנטיגן נושא על פני השטח של תאי דנדריטים זקיקים ותאי B בתהליך של חיטוט אנטיgen במהלך התגובה החיסונית באיברים הלימפה משניים.

Protocol

התקנת Multi-מרישים לTPLSM פסים תאורה ההגדרה המשמשת כאן היא מיקרוסקופ רב קרן מיוחדת שני פוטונים לייזר סריקה, כפי שתוארה לעיל 6,20. המערכת מתוארת באיור 1. הגישה יכולה להיות מיושמת על מיקרוסקופים אחרים שני פוטונים לייזר סריקה…

Representative Results

רזולוציה מרחבית בבלוטות הלימפה הממדים של התפקוד היעיל נקודת ההתפשטות (ePSF) מתאימות לרזולוציה מרחבית של מיקרוסקופ 12. מדדנו שלוש ממדי פונקציה זאת על ידי רכישת אות דור הרמוניות השנייה של סיבי הקולגן בבלוטות לימפה על ידי MB-SI-TPLSM ש?…

Discussion

המטרה של הדמיה אופטית intravital היא דינמי ופונקציונלי כדי להמחיש תנועתיות ואינטראקציות הסלולר על מנת להבין רקמות ותפקוד איברים בבריאות ובחוליים ^5. טכנולוגיה רבת עוצמה ביותר להשגה, מיקרוסקופית לייזר סריקה רב פוטון זה, עדיין יש להתגבר על מגבלות הקשורות לנופף עיוותי…

Materials

ATTO590 – NSH for coupling	ATTO Tec, Germany	AD-590-35	–
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590	DRFZ, Berlin	–	The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US	–	Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment	StemmCell Technologies, Germany	19854	–
Polystyren beads (605), 0.2 µm	Life Technologies, Germany	F8803	–
Name of Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany	–	–
OPO (manual version)	APE, Berlin, Germany	–	–
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Germany	–	–
water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Germany	–	–