胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡
Summary
成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。
Abstract
生体深部組織の多光子顕微鏡による細胞の通信を監視することは、健康と病気の太い組織サンプルや臓器内の免疫細胞の運命を理解するための鍵となります。多光子顕微鏡の走査パターンを制御し、適切な数値計算アルゴリズムを適用することによって、我々は、3倍より良い軸方向分解能及び改善された信号対雑音比を達成することを可能にする、ストライプ状照明アプローチを開発し、 すなわちコントラスト、以上で標準の多光子顕微鏡法と比較して、非常にリンパ器官の組織の散乱内100μmの組織の深さ。撮像深度による磁界検出器の使用にわずかに低かったのに対し、取得速度、ならびに光退色および光損傷効果は、標準的な光電子増倍管ベースの手法と同様であった。ストライプ照明アプローチを使用することにより、我々は、二次濾胞樹状細胞上の免疫複合体沈着物の動態を観察することができる̵1;胚中心のいくつかのタンパク質分子のレベルで。
Introduction
二光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）、赤外線、超短パルス励起1に関連の深い組織のイメージングのための利点で、様々の運動性との相互作用のパターンを明らかにすることによって、単一細胞レベルでの生命過程に関する我々の見解に革命をもたらしました動物の2-5を生きた細胞サブセット。しかし、現在の技術は、それが健康と病気における組織内の細胞応答の分子基盤に関する唯一のまばらな情報をレンダリングするので、新たな治療戦略を開発するための前提条件として臓器機能と機能障害のメカニズムを解明するために、まだ不十分である。現在の技術は、散乱による数百ミクロンの唯一の空間的な窓を可能にし、空間分解能と成体動物の非常にコンパクトな組織で特に明白である信号対雑音比6、フロント歪みの影響を振る。これらの散乱や波面歪みの影響は非常に異質ANによるものである3D空間分解能の深さに依存する劣化への第一歩でも有数の組織における屈折率のD異方性分布し、最終的に弾道励起光子、信号対雑音比、すなわち喪失に起因する信号の全損失に。生命科学や生物医学深部組織用途の観点では、これは現在の技術は、信号対雑音比の低下は、システムがいくつかを見落とす原因となるのに対して乏しい分解能は偽陽性の相互作用をもたらすので一概にセルラー通信を明らかにすることができないことを意味する薄暗い構造間の相互作用。
明白に動的な方法で細胞間相互作用を検出するために、非常に改善された空間分解能が深部組織内で必要とされる。第一励起状態の枯渇で現在導入された強力な特殊な数値計算アルゴリズムに基づいてナノスコピー技術、 例えば構造照明のアプローチ、 例えば 、 </em> STED、RESOLFT、または分子の局在について、 例えば dSTORM、Palmは、固定された細胞にだけでなく、生きた細胞培養7で多くのアプリケーションを発見した。しかし、組織切片、生体組織や生物にこれらのアプリケーションを拡張するために、我々はまだ深刻な技術的な問題を克服する必要があります。二光子励起は、異なる波長で、並びに励起用の単一波長（sw2PE-STED）でSTEDおよび発光が同じで、それぞれ埋め込 まれた細胞9を用いて脳切片8または人工マトリックス中に横方向の解像度を向上させるために適用された刺激標準TPLSMとして距離分解能。 1光子STEDを使用して、樹状突起棘のダイナミクスは、67〜10nm程度の分解能で生きTHY1 EGFPマウスの脳皮質（最大10から15ミクロンの深さ）の表面に画像化することができた。発生生物学のための多目的なツールは2倍に改善された2Dを提供し、多焦点構造化照明顕微鏡によって提供されている解像度。しかしながら、この技術は、例えば、ゼブラフィッシュ胚11と光散乱の低い傾向を有する生物において使用することができる。それでも、これらの技術はいずれも、出産後発症を伴う疾患の生物医学および臨床研究のための重要なモデルであり、数百μm、大人の動物の高度に散乱組織に適用することはできません。
点広がり関数（PSF）、すなわち 、回折限界の波面形状を計算するために使用される近似の独立したが、レンズを通して集束した後、光軸（距離分解能）に沿ったPSFの幅よりも少なくとも3倍大きい光軸（横方向の解像度）12に垂直PSF幅。ゼルニケの係数によって定量化異なる次数の前歪みはかなり、特に視神経に沿って、はるかに大きいのPSFにつながる深部組織イメージングに集中電磁波の波面形状を変更し、波13〜15軸A1。したがって、回折法および波面歪み効果の両方が深い組織イメージングの制限要因としての光軸に沿って解像度を指しています。ナノスの技術は、回折限界を打ち消す一方のみに焦点を当て、軸方向分解能と回折波面歪みの影響の両方に対抗してコントラストを向上させる技術は、高解像度の生体内イメージングのために必要とされる。理想的には、この技術は十分な速さで、携帯動態のモニタリングを可能にするためにもである必要があります。
PSF異常とTPLSMにおける補償光学を用いたコントラスト損失のリアルタイム補正が盛んに研究され、過去十13,14,16-18に改善され、したがって、弾道励起のより良い管理につながる現時点で得られる最善の選択であるされています光子は14。まだ、原因ほとんどはフロント補正を振ることに補償光学で使用されるアプローチ反復的であり、彼らは、HA、その小領域ごとに繰り返さなければVEの（数10×10〜2）は、組織における屈折率の高い不均一性のために、取得速度は、細胞運動性および通信を画像化するために必要なよりも著しく低い。また、適応光学における物理的限界はTPLSMはまだ回折によって決定され改善された。
illumination（SPIN）及び検出側（SPADE）上の時間変調の空間変調は、理論的に解像度を向上させるレーザ走査顕微鏡法に適用することが提案されている。生体内イメージングでの実用化はまだ19を実証されていない。
一緒になって、生きている成体動物における深部組織の画像化の解像度を向上させる技術の開発のための高い需要が存在する。本研究では、マルチビームストライプ照明多光子レーザーの走査プロセスを制御することにより、励磁パターンの空間変調を実現缶詰顕微鏡（MB-SI-MPLSM）20。励起ビーム断面が空間的に変調された構造化照明のアプローチに反して、我々は、励起の空間変調を実現するためにのみスキャン処理を用いる。より長い波長に励起を拡張することによって、我々は独立して、光の、高散乱組織（ 例えばリンパ節、自由散乱路47ミクロン6）の深部組織における空間分解能と信号対雑音比の両方を改善することができる我々は検出非線形の信号、 例えば蛍光、第二高調波発生や他の周波数ミキシング現象。 900 nmの最大励起波長でこのアプローチを用いて、我々は、マウスのリンパ節の胚中心における少数の分子の規模で動的に画像細胞タンパク質構造にできる。従って、我々は良好な抗プロービングの過程で濾胞樹状細胞およびB細胞の表面上の抗原搬送ユニット間の相互作用を視覚化することができ二次リンパ器官における免疫応答の間GEN。
Protocol
Representative Results
Discussion
生体内光学的イメージングの目的は、動的におよび機能的に健康と病気5における組織および器官の機能を理解するために、細胞運動性および相互作用を可視化することである。その空間分解能、コントラスト並びにその時間分解能を制限し、これを達成するための最も強力な技術、多光子レーザ走査顕微鏡法、依然として前方歪み波に関連する制限を克服しなければならず、散乱、?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、C57BL / 6、B1-8 GFPトランスジェニックマウスを提供するためのストライプ化照明手法、K. RajewskyとA.ハーバーマンの開発中に実りある議論をR. Heintzmannに感謝します。私たちは、経済的支援のために（RNに）助成金Rahel-ハーシュフェローシップの下シャリテ、（AEH）はHA5354/4-1とSFB633、プロジェクトA15、（RN）の助成金NI1167/3-1の下でドイツ学術振興を認める。私たちは、特に有益な議論やインフラをサポートするためにネットワークJIMIを認める
Materials
| ATTO590 – NSH for coupling | ATTO Tec, Germany | AD-590-35 | – |
| CD21/35 – Fab fragment – ATTO590 | DRFZ, Berlin | – | The coupling reaction was performed in the central lab of our institution. |
| B1-8 Jk-/- EGFP+ | Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US | – | Can be also found at Jackson Laboratories (JAX). |
| EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment | StemmCell Technologies, Germany | 19854 | – |
| Polystyren beads (605), 0.2 µm | Life Technologies, Germany | F8803 | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| TriMScope I | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | – | – |
| OPO (manual version) | APE, Berlin, Germany | – | – |
| Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II | Coherent, Duisburg, Germany | – | – |
| water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm | Olympus Germany, Hamburg, Germany | – | – |
Riferimenti
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).
- Esplugues, E., et al. Control of Th17 cells occurs in the small intestine. Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).
- Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Herz, J., et al. Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator. Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).
- Hell, S. W., Rittweger, E. Microscopy: Light from the dark. Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).
- Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy. Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).
- Bianchini, P., et al. Single-wavelength two-photon excitation – stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).
- Berning, S., et al. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551 (2012).
- York, A. G., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).
- Gu, M. . Advanced optical imaging. , (2001).
- Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy. J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).
- Booth, M. J. Adaptive optics in microscopy. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).
- Niesner, R., et al. The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).
- Rückel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).
- Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).
- Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues. Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).
- Lu, J., et al. Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation. Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).
- Andresen, V., et al. High-resolution intravital microscopy. PLoS ONE. 7 (12), (2012).
- Debarre, D., et al. Adaptive optics for structured-illumination. Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).
