क्षणिक प्रमुख चयन की विधि का उपयोग करके फ्लोरोसेंट रूप से टैग किए गए प्रोटीन को एक साथ व्यक्त करने वाले रीकॉम्बिनेंट वैक्सिनिया वायरस की पीढ़ी के लिए एक तेजी से और मॉड्यूलर प्रोटोकॉल यहां वर्णित है।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ वायरल प्रोटीन की टैगिंग वायरस-मेजबान बातचीत की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए एक अपरिहार्य दृष्टिकोण साबित कर दिया है । वैक्सिनिया वायरस (VACV), चेचक के उन्मूलन में उपयोग किया जाने वाला लाइव टीका, विशेष रूप से अपने बड़े विरियन आकार और आसानी के कारण फ्लोरोसेंट लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के लिए उत्तरदायी है जिसके साथ इसे जीनोम स्तर पर इंजीनियर किया जा सकता है। हम यहां पुनः संयोजन वायरस पैदा करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं। वैसिनिया प्रतिकृति के दौरान लक्षित समरूप पुनर्संयोजन के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं का निर्धारण किया गया था, जो निर्माण उत्पादन के सरलीकरण की अनुमति देता है। इसने फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और मेटाबोलिक चयन के साथ क्षणिक प्रमुख चयन (टीडीएस) के गठबंधन को फ्लोरोसेंटी लेबल वायरल प्रोटीन के लिए एक तेजी से और मॉड्यूलर दृष्टिकोण प्रदान करने में सक्षम बनाया। फ्लोरोसेंट रीकॉम्बिनेंट वायरस की पीढ़ी को व्यवस्थित करके, हम वायरस की प्रतिकृति के दौरान होने वाले वायरस-होस्ट इंटरप्ले के कई पहलुओं के उन्नत इमेजिंग विश्लेषण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को सुविधाजनक बनाने में सक्षम हैं।
वैक्सिनिया वायरस (VACV) प्रोटोइटिक पॉक्सवायरस है और चेचक के कारक एजेंट वेरिओला वायरस से अत्यधिक संबंधित है। ये दोनों वायरस ऑर्थोपॉक्स जीनस के सदस्य हैं जिसमें अन्य उल्लेखनीय रोगजनक जैसे मंकीपॉक्स और एक्रोमेलिया वायरस (माउसपॉक्स)1शामिल हैं। ऑर्थोपॉक्सवायरस में बड़े डबल-फंसे डीएनए जीनोम (180-220 केबी) होते हैं जो 200 के ऊपर की ओर अनुमानित खुले पढ़ने के फ्रेम2,3हैं। इन वायरसों की प्रतिकृति में पेरिन्यूक्लियर वायरस कारखाने का गठन शामिल है, जहां परिपक्व वायरस (एमवी) बनाए जाते हैं, और ट्रांस-गोल्गी नेटवर्क जहां एमवी का एक सबसेट लिपटे वायरस (डब्ल्यूवी) (रॉबर्ट्स और स्मिथ4द्वारा समीक्षा) उत्पन्न करने के लिए दो अतिरिक्त झिल्ली प्राप्त करता है। आर्थोपॉक्स जीनोम उच्च मात्रा में आनुवंशिक पुनर्संयोजन के कारण आनुवंशिक हेरफेर के लिए अत्यधिक उत्तरदायी होते हैं जो वावी जीनोम प्रतिकृति की एक विशेषता है और वायरल डीएनए पॉलीमरेज5द्वारा मध्यस्थता की जाती है। पुनः संयोजन वायरस पैदा करना समरूप पुनर्संयोजन और रैखिक डीएनए अणुओं पर निर्भर करता है, जो समरूपता के साथ छोटे होते हैं क्योंकि 12 बीपी वैक्सिनिया वायरस संक्रमित कोशिकाओं में पुनर्संयोजन में मध्यस्थता करने के लिए पर्याप्त है6। वैक्सिनिया वायरस के फ्लोरोसेंट लेबलिंग से आर्थोपॉक्स कणों के बड़े आकार के कारण बेहद उज्ज्वल वायरस कण पैदा हो सकते हैं, जो प्रति वीरन7कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन के समावेश की अनुमति देता है। Vaccinia विदेशी डीएनए 8 के बड़े टुकड़े ले जाने की क्षमता है औरइसके अलावा, कठोर कैप्सिड समरूपता की कमी लचीलापन की एक डिग्री की अनुमति हो सकती है जब उनके अंतर्जात loci9से वायरल प्रोटीन जीन संलयन व्यक्त । VACV प्रोटीन की फ्लोरोसेंट टैगिंग उपकोशिकीय स्तर पर मेजबान-रोगजनक बातचीत के अध्ययन के लिए अमूल्य साबित हुई है, विशेष रूप से वायरस प्रवेश10,परिवहन11-13,और मॉर्मोजेनेसिस के क्षेत्र में, विशेष रूप से लिपटे हुए विरियंस7।
एक तनु विकास फेनोटाइप14,15,मेटाबोलिक चयन16-18,या मार्कर जीन की अभिव्यक्ति(जैसे एक्स-गल 19 या फ्लोरोसेंट प्रोटीन13,20)के बचाव से पुनः संयोजन वायरस का चयन किया जा सकता है। यहां हम फ्लोरोसेंट और मेटाबोलिक चयन के एक शक्तिशाली संयोजन का उपयोग कर फ्लोरोसेंट वायरस के चयन का वर्णन करते हैं। फॉल्कनर और मॉस (1 99 0)21द्वारा विकसित क्षणिक प्रमुख चयन (टीडीएस) वैक्टर, रुचि के वांछित फ्लोरोसेंटली टैग किए गए जीन के साथ मार्कर को एकीकृत करने की अनुमति देते हैं। जब मेटाबोलिक चयन को हटा दिया जाता है, तो एक माध्यमिक पुनर्संयोजन घटना हो सकती है जो चयन जीन को उत्पादित करती है, लेकिन फ्लोरोसेंटली टैग किए गए वायरस प्रोटीन को बरकरार छोड़ देती है। नीचे चित्रा 2 प्रायोगिक प्रक्रिया का अवलोकन प्रदान करता है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चयन जीन एमसीएचरी और एस्चेरिचिया कोलाई ग्वानाइन फॉस्फोरिबोसाइलट्रांसफरेज(जीपीटी)जीन हैं, दोनों एक सिंथेटिक अर्ली/लेट वायरल प्रमोटर से व्यक्त किए गए हैं और पहले कॉर्डेरो एट अल द्वारा उपयोग किए जाते थे। 22 इसके अलावा, ब्याज के टैग किए गए फ्यूजन प्रोटीन का फ्लोरेसेंस है। जब मेटाबोलिक चयन को हटा दिया जाता है, तो चयन योग्य मार्कर(रीचेरी और जीपीटी)को उत्पादित किया जाता है, जिससे केवल टैग किए गए जीन का फ्लोरेसेंस होता है, जो सही पुनः संयोजन वायरस की पहचान की अनुमति देता है। चयन मार्कर का एक्सिक्शन कई फ्लोरोसेंट टैग को संयोजित करने की संभावना प्रदान करता है, जिससे हमें एक साथ कई वायरल प्रोटीन को फ्लोरोसेंटी लेबल करने की क्षमता के साथ वायरस बनाने में सक्षम बनाया जा सके। पिछले अध्ययनों ने6वैक्सिनिया वायरस संक्रमित कोशिकाओं में संक्रमित रैखिक और परिपत्र डीएनए अणुओं के वैक्सिनिया पुनर्संयोजन के लिए न्यूनतम होमोलॉजी आवश्यकताओं को निर्धारित किया है। हम वैसिनिया वायरल जीनोम में अपने समावेश के माध्यम से जीपीटी-mCherry टीडीएस वेक्टर में फ्लैंकिंग हथियारों की अलग-अलग होमोलॉजी लंबाई की पुनर्संयोजन क्षमता निर्धारित करना चाहते थे। यह निर्धारित किया गया था कि टीडीएस वेक्टर में 100 बीपी के मुताबिक़ क्षेत्र वीएसवी जीनोम में पुनर्संयोजन डीएनए के सम्मिलन को लक्षित करने औरमध्यस्थताकरने के लिए पर्याप्त हैं। जबकि छोटे होमोलॉजी लंबाई भी पुनर्संयोजन को सक्षम करेगी, 100 बीपी होमोलॉजी लंबाई ने पर्याप्त पुनर्संयोजन वायरस प्रदान किए जिन्हें मेटाबोलिक और फ्लोरोसेंट चयन के साथ आसानी से पहचाना जा सकता है। इस आकार के डीएनए टुकड़ों को अपेक्षाकृत कम लागत पर व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है और पुनर्संयोजन वायरस के निर्माण के लिए कई वैक्टर के उत्पादन की बहुत सुविधा प्रदान करता है। हमने फ्लैंकिंग क्षेत्रों के ओलिगोन्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के संश्लेषण की लागत को कम रखते हुए अधिक पुनर्संयोजन आवृत्ति प्रदान करने के लिए होमोलॉजी की लंबाई को 150 बीपी तक बढ़ाने का विकल्प चुना।
यह तकनीक पुनः संयोजन वायरस के निर्माण के लिए एक कुशल और मॉड्यूलर प्रोटोकॉल का वर्णन करती है जो फ्लोरोसेंट रूप से वायरल प्रोटीन को टैग करता है। विधि यह सुनिश्चित करती है कि वायरल जीनोम में एकमात्र परिवर्तन टैग या मार्कर के अलावा है, जो कोई चयन मार्कर को पीछे नहीं छोड़ता है। समरूप पुनर्संयोजन के लिए आवश्यक छोटी बांह की लंबाई इसके प्रत्यक्ष संश्लेषण को सक्षम बनाती है, जो पीसीआर और क्लोनिंग के कई समय लेने वाले दौर को नष्ट करती है, जबकि रीचेरी और मेटाबोलिक जीपीटी चयन की फ्लोरेसेंस का उपयोग वायरल पुनर्संयोजन मध्यवर्ती को अलग करने के लिए किया जाता है। इन मध्यवर्ती हल किया जा सकता है, चयन को हटाने के बाद, एक टैग जीन के साथ एक वायरस के लिए या माता पिता के प्रकार के लिए वापस । फ्लोरोसेंट और मेटाबोलिक चयन दोनों के उपयोग को शामिल करने वाली एक समान विधि को पहले27 वर्णित किया गया है, हालांकि इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली विधि होमोलॉजी के छोटे, संश्लेषित क्षेत्रों का उपयोग करती है, जिससे ब्याज के टैग किए गए जीन के फ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा वांछित पुनर्संयोजन वायरस की पहचान की अनुमति मिलती है। यह द्वितीयक चयन केवल अत्यधिक व्यक्त वायरल जीन को टैग करने के लिए लागू होता है जो पट्टिका परख में पर्याप्त फ्लोरेसेंस का उत्पादन करते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोई भी एक पूर्ण अभिव्यक्ति कैसेट के सम्मिलन की परिकल्पना कर सकता है, उदाहरण के लिए एक मजबूत वायरल प्रमोटर के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन। इस मामले में बाएं और दाएं हथियार वायरल जीन को टैग करने के बजाय प्रविष्टि के बिंदु को परिभाषित करेंगे।
कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जो प्रायोगिक प्रक्रिया के दौरान सहायक साबित हुए। ऊपर वर्णित चरण २.३.३ में तरल ओवरले लाल/हरे फ्लोरोसेंट सजीले टुकड़े का पता लगाने और अलगाव के लिए महत्वपूर्ण साबित हुआ । हमारा मानना है कि जीपीटी चयन अभिकर्षकों और एगरेंग ओवरले के संयोजन ने पुनर्संयोजन वायरस के विकास को विचलित कर दिया और इसलिए ट्रांसफैक्शन के बाद वायरस को बढ़ाने के पहले कदम के लिए तरल ओवरले में बदल दिया। संवर्धन और शुद्धिकरण के लिए स्थानीय टैग रंग फ्लोरेसेंस दिखा फ्लोरोसेंट सजीले टुकड़े चुनना भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि बाएं हाथ के पुनर्संयोजन के परिणामस्वरूप मध्यवर्ती को सजीले टुकड़े में मनाया जाता है यदि बाएं हाथ में भी प्रमोटर अनुक्रम होता है। टीडीएस वेक्टर में एमसीएचरी मार्कर जीन को जीएफपीद्वारा भी प्रतिस्थापित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट टैग के रूप में रीचेरी के आसान समावेश और चयन के लिए अनुमति देने के लिए।
ऊपर वर्णित कुछ तकनीकें पुनर्संयोजन वैक्सिनिया वायरस बनाने के स्थापित तरीकों से थोड़ी भिन्न होती हैं। उदाहरण के लिए, पुनर्संयोजन बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले वायरस का एमओआई सामान्य रूप से 128से कम होता है, हालांकि इस विधि द्वारा पुनर्संयोजन वैक्सिनिया वायरस के निर्माण के लिए उच्च एमओआई का उपयोग पर्याप्त रहा है। जीपीटी चयन अभिकर्मकों के उपयोग के लिए आम तौर पर चयन अभिकर्मक18के साथ कोशिकाओं के पूर्वकरण की आवश्यकता होती है, हालांकि उन्हें बचाव चरण के दौरान जोड़ने के बाद संक्रमण अभी भी वांछित पुनर्संयोजन का पर्याप्त चयन प्रदान किया, विशेष रूप से फ्लोरोसेंट चयन मार्कर की उपस्थिति के कारण भी।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इस तकनीक की सीमाओं में से एक यह है कि माध्यमिक फ्लोरेसेंस चयन कदम ब्याज के टैग किए गए प्रोटीन पर निर्भर करता है, एक स्तर पर जो पट्टिका परख में आंखों द्वारा इसका पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसके बिना, वायरस को शुद्ध करना संभव होगा जो केवल रीचेरी फ्लोरेसेंस प्रदर्शित करते हैं, जिनमें से कम से कम 50% वांछित पुनर्संयोजन वायरस होते हैं, जिन्हें ऊपर चरण 2.12 में वर्णित पीसीआर जैसी आणविक रणनीतियों द्वारा पहचाना जा सकता है। एक और सीमा उनके टैगिंग के परिणामस्वरूप कुछ प्रोटीन की निष्क्रियता हो सकती है। फ्लोरोसेंट टैग म्यूटेशन से गुजरना या समय के साथ पासएजिंग के साथ recombinant वायरस द्वारा excised हो सकता है । इसलिए माइक्रोस्कोपी और पीसीआर द्वारा रिकॉम्बिनेंट वायरस स्टॉक के नियमित सैंपलिंग की सिफारिश की जाती है। अंत में, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की संख्या की एक सीमा हो सकती है जिसे एक ही वायरस में शामिल किया जा सकता है। इसका एक पहलू उन सभी को एक साथ कल्पना करने की क्षमता है; उपलब्ध फ्लोरोसेंट टैग के उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की ओवरलैपिंग प्रकृति को देखते हुए, न्यूनतम स्पेक्ट्रल ब्लीड-थ् माध्यम से सुनिश्चित करने के लिए उन्हें सावधानीपूर्वक चुनना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, जीएफपी और सेरूलन जैसे बारीकी से संबंधित टैग का उपयोग करने से दोनों के बीच पुनर्संयोजन की संभावना खुल ती है, जो पुनर्संयोजन जीनोम में उनके स्थानों पर निर्भर करता है।
इस तकनीक की मॉड्यूलर प्रकृति अन्य धुंधला और/या टैग विकल्पों के साथ अनुकूलता के आधार पर फ्लोरोसेंट टैग के सरल प्रतिस्थापन को सक्षम बनाती है । चुनिंदा मार्कर को उत्तेजित करके, टीडीएस विधि विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन के धारावाहिक को जोडऩे या फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए टीडीएस आधारित जीन विलोपन के साथ टीडीएस आधारित टैगिंग के संयोजन के लिए अनुमति देती है29का विश्लेषण करती है। इस दृष्टिकोण की उपयोगिता के लिए एक उदाहरण के रूप में, एक डबल-टैग फ्लोरोसेंट वायरस जो वायरस कोर और डब्ल्यूवी झिल्ली को लेबल करता है। इस वायरस के साथ इमेजिंग अध्ययन वायरस प्रतिकृति के दौरान आंदोलन, मॉर्फोजेनेसिस और वायरस के लपेटन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अभी तक अस्वाभावित vaccinia वायरल प्रोटीन भी टैग किया जा सकता है और इस तकनीक से अध्ययन किया ।
वायरस की कई विशेषताओं के कारण वैक्सिनिया वायरस का बड़े पैमाने पर इमेजिंग अध्ययनों में उपयोग किया गया है जो लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी के अनुकूल हैं। फ्लोरोसेंट टैग वायरल जीनोम से व्यक्त किए जाते हैं, जिससे ट्रांसफैक्शन की आवश्यकता को समाप्त किया जाता है, जिससे संक्रमित जानवरों या गैर-संक्रमण कोशिकाओं से प्राप्त प्राथमिक कोशिकाओं को आसानी से विश्लेषण किया जा सके। प्रारंभ में, फ्लोरोसेंट VACVs का उपयोग वायरस आंदोलन30के सरल उपकोशिकीय ट्रैकिंग के लिए किया गया था, लेकिन हाल के दृष्टिकोणों में एफपीटी अध्ययन31,एकल वायरस कणों पर एफईआरपी32,प्रमोटर रिपोर्टर्स33,इंट्राविटल इमेजिंग34और संरचनात्मक अध्ययन35-37शामिल हैं। इन सभी तकनीकों को आसान और करीब पहुंच के भीतर हो सकता है फिर से संयोजन फ्लोरोसेंट वायरस बनाने की इस विधि के साथ मिलकर ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को ऑस्ट्रेलियन रिसर्च काउंसिल फेडरेशन डिस्कवरी प्रोजेक्ट ग्रांट #1096623 द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
Mycophenolic acid | Sigma-Aldrich | M3536-50MG | Dissolve in 0.1N NaOH |
Xanthine | Sigma-Aldrich | X0626-5G | Dissolve in 0.1N NaoH |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 | Olympus, Chroma | BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) |