Ett snabbt och modulärt protokoll för generering av rekombinanta vacciniavirus som uttrycker fluorescerande märkta proteiner samtidigt med hjälp av metoden för övergående dominerande urval beskrivs här.
Märkning av virusproteiner med fluorescerande proteiner har visat sig vara ett oumbärligt tillvägagångssätt för att främja vår förståelse av virus-värdinteraktioner. Vacciniavirus (VACV), det levande vaccinet som används vid utrotning av smittkoppor, är särskilt mottagligt för fluorescerande levande cellmikroskopi på grund av dess stora virionsstorlek och den lätthet med vilken det kan konstrueras på genomnivå. Vi rapporterar här ett optimerat protokoll för att generera rekombinanta virus. De minimala kraven för riktad homolog rekombination under vaccinia replikering fastställdes, vilket möjliggör förenkling av konstruktion generation. Detta möjliggjorde alliansen av transient dominerande urval (TDS) med en fluorescerande reporter och metaboliskt urval för att ge en snabb och modulär strategi för fluorescerande etikett virala proteiner. Genom att effektivisera genereringen av fluorescerande rekombinanta virus kan vi underlätta nedströmsapplikationer som avancerad bildanalys av många aspekter av virus-värd samspelet som uppstår under virusreplikation.
Vaccinia virus (VACV) är prototypiska poxvirus och mycket relaterade till variola virus, orsakssambandet till smittkoppor. Båda dessa virus är medlemmar av ortopoxläktet som innehåller andra anmärkningsvärda patogener som monkeypox och ectromelia virus (mousepox)1. Ortopedvirus har stora dubbelsträngade DNA-genom (180-220 kb) som kodar uppemot 200 förväntade öppna läsramar2,3. Replikering av dessa virus innebär bildandet av en perinukleär virusfabrik, där mogna virus (MV) tillverkas, och trans-Golgi-nätverket där en delmängd av MV förvärvar ytterligare två membran för att generera inslagna virus (WV) (granskas av Roberts och Smith4). Ortopedigenom är mycket mottagliga för genetisk manipulering på grund av den höga graden av genetisk rekombination som är ett inslag i VACV-genomreplikation och förmedlas av den virala DNA-polymerasen5. Att generera rekombinanta virus bygger på homolog rekombination och linjära DNA-molekyler med homologier så små som 12 bp är tillräckliga för att medla rekombination i vaccinia virusinfekterade celler6. Fluorescerande märkning av vacciniavirus kan ge extremt ljusa viruspartiklar på grund av den stora storleken på ortopoxpartiklar, vilket gör det möjligt att införliva många fluorescerande proteiner per virion7. Vaccinia har kapacitet att bära stora fragment av främmande DNA8 och dessutom kan bristen på styv kapsidsymmetri tillåta en viss flexibilitet när man uttrycker virala proteingenfusioner från deras endogena lokus9. Fluorescerande märkning av VACV-proteiner har visat sig vara ovärderlig för studier av värdpatogeninteraktioner på subcellulär nivå, särskilt inom området för virusinmatning10,transport11-13, och morfogenes, särskilt av inslagna virioner7.
Rekombinanta virus kan väljas genom räddning av en försvagad tillväxtfenotyp 14,15,metaboliskturval 16-18, eller genom uttryck av en markörgen (t.ex. X-gal19 eller fluorescerande protein13,20). Här beskriver vi valet av fluorescerande virus med hjälp av en kraftfull kombination av fluorescerande och metaboliskt urval. Transient dominerande urval (TDS) vektorer, utvecklat av Faulkner och Moss (1990)21, tillåter markörer att integreras tillsammans med den önskade fluorescerande taggade genen av intresse. När metaboliskt urval tas bort kan en sekundär rekombinationshändelse inträffa som tar bort urvalsgenerna, men lämnar det fluorescerande märkta virusproteinet intakt. Figur 2 nedan ger en översikt över försöksförfarandet. De urvalsgener som används i denna studie är mCherry och genen Escherichia coli guanine fosforibosyltransferase (gpt), båda uttryckta från en syntetisk tidig/sen viral promotor och används tidigare av Cordeiro et al. 22 Dessutom finns det fluorescens av det märkta fusionsproteinet av intresse. När metaboliskt val tas bort strukits de valbara markörerna (mCherry och gpt) och lämnar endast fluorescensen hos den märkta genen, vilket gör det möjligt att identifiera rätt rekombinanta virus. Excisionen av urvalsmarkörerna ger möjlighet att kombinera flera fluorescerande taggar, vilket gör det möjligt för oss att skapa virus med förmågan att fluorescerande märka flera virusproteiner samtidigt. Tidigare studier har fastställt de minimalahomologiska kraven för vaccinia rekombination av linjära och cirkulära DNA-molekyler transfecterade till vaccinia virusinfekterade celler6. Vi ville fastställa rekombination effektivitet av varierande homology längder av flankerande armar i gpt-mCherry TDS vektor genom dess införlivande i vaccinia viral genom genom. Det fastställdes att homologa regioner på 100 bp i TDS-vektorn är tillräckliga för att rikta in sig på och förmedla införandet av rekombinant DNA i VACV-genomet genom homolog rekombination (figur 4). Medan mindre homologi längder skulle också möjliggöra rekombination, 100 bp homology längder gav tillräckligt rekombinanta virus som lätt kan identifieras med metabola och fluorescerande urval. DNA-fragment av denna storlek kan syntetiseras kommersiellt till relativt låg kostnad och underlättar i hög grad produktionen av flera vektorer för att skapa rekombinanta virus. Vi valde att öka homologi längd till 150 bp att ge större rekombination frekvens samtidigt hålla nere kostnaderna för syntes av oligonucleotide sekvensen av flankerande regioner.
Denna teknik beskriver ett effektivt och modulärt protokoll för skapandet av rekombinanta virus som uttrycker fluorescerande taggade virusproteiner. Metoden säkerställer att den enda ändringen av virusgenomet är tillsats av en tagg eller markör, vilket inte lämnar några markeringsmarkörer bakom sig. Den korta armlängds avstånd som krävs för homolog rekombination möjliggör dess direkta syntes, vilket eliminerar flera tidskrävande rundor PCR och kloning, medan fluorescensen av mCherry och metaboliskt GPT-urval används för att isolera viral rekombination mellanliggande ämnen. Dessa intermediärer kan lösas, efter borttagning av urval, till ett virus med en taggad gen eller tillbaka till föräldratypen. En liknande metod som omfattar användning av både fluorescerande och metaboliska urval har beskrivitstidigare 27 även om metoden som används i denna studie använder kortare, syntetiserade regioner av homologi, vilket gör det möjligt att identifiera önskat rekombinant virus genom att avbilda fluorescensen hos den taggade genen av intresse. Detta sekundära urval är endast tillämpligt för märkning av starkt uttryckta virusgener som producerar tillräcklig fluorescens i en plackanalys. Alternativt kan man tänka sig att en komplett uttryckskassett införs, till exempel ett fluorescerande protein under en stark viral promotor. I detta fall skulle vänster och höger armar definiera insättningspunkten snarare än den virala genen som ska märkas.
Det finns några viktiga steg som visade sig vara till hjälp under experimentproceduren. Vätskeöverlägget i steg 2.3.3 som beskrivs ovan visade sig vara avgörande för detektion och isolering av röda/gröna fluorescerande plack. Vi tror att kombinationen av GPT urval reagenser och agarose överlägg avskräckte tillväxten av rekombinanta virus och därför bytte till ett flytande överlägg för det första steget att förstärka virus efter transfection. Det är också viktigt att plocka fluorescerande plack som visar lokaliserad taggfärg fluorescens för berikning och rening, eftersom intermediärer som härrör från vänster arm rekombination kan resultera i diffus fluorescens observeras i plack om vänster arm också innehåller en promotorsekvens. MCherry markör genen i TDS vektor kan också ersättas av gfp, till exempel för att möjliggöra enkel införlivande och val av mCherry som en fluorescerande tagg.
Vissa tekniker som beskrivs ovan varierar något från etablerade metoder för att skapa rekombinant vaccinia virus. Till exempel är moi av virus som används för att skapa rekombinanter normalt mindre än 128, men användningen av högre MOI har varit tillräcklig för att skapa rekombinant vacciniavirus med denna metod. Användningen av GPT urval reagenser kräver normalt preincubation av cellerna med urval reagenser18, men lägga till dem under räddningsfasen post-infektion fortfarande gav tillräckligt urval av önskade rekombinanter, särskilt på grund av förekomsten av en fluorescerande urvalsmarkör också.
Som nämnts tidigare är en av begränsningarna i denna teknik att det sekundära fluorescensvalsteget förlitar sig på att det märkta proteinet av intresse uttrycks högt, på en nivå som möjliggör dess upptäckt med öga i en plackanalys. Utan detta skulle det vara möjligt att rena virus som bara uppvisade mCherry fluorescens, varav minst 50% skulle innehålla önskade rekombinanta virus, som kan identifieras av molekylära strategier som PCR beskrivs i steg 2.12 ovan. En annan begränsning kan vara inaktivering av vissa proteiner som ett resultat av deras märkning. Fluorescerande taggen kan genomgå mutationer eller strukits av det rekombinanta viruset med passaging över tiden. Därför rekommenderas regelbunden provtagning av rekombinanta viruslager genom mikroskopi och PCR. Slutligen kan det finnas en gräns för antalet fluorescerande märkta proteiner som kan införlivas i ett enda virus. En aspekt av detta är förmågan att visualisera dem alla samtidigt; Med tanke på att utsläppsspektrat av tillgängliga fluorescerande taggar överlappar varandra är det viktigt att välja dem noggrant för att säkerställa minimal spektralblödning. Dessutom öppnar användningen av närbesläktade taggar som GFP och Cerulean möjligheten till rekombination mellan de två, beroende på deras platser i det rekombinanta genomet.
Den modulära karaktären hos denna teknik möjliggör enkel ersättning av fluorescerande taggar baserat på kompatibilitet med andra färgnings- och / eller taggval. Genom att excising valbara markörer möjliggör TDS-metoden seriell tillsats av olika fluorescerande proteiner eller kombinationen av TDS-baserad märkning med TDS-baserade genborttagningar för fenotypiska analyser29. Som ett exempel för nyttan av den här metoden genererades ett dubbelmärkt fluorescerande virus som märker viruskärnor och WV-membranet. Imaging studier med detta virus kan användas för att studera rörelse, morfogenes och inslagning av virus under virus replikering. Ännu okarakteriserade vaccinia virala proteiner kan också märkas och studeras med denna teknik.
Vacciniavirus har använts i stor utsträckning i bildstudier på grund av många egenskaper hos viruset som är gynnsamma för levande cellmikroskopi. Fluorescerande taggar uttrycks från det virala genomet, vilket eliminerar behovet av transfection, vilket gör det möjligt att enkelt analysera primärceller som härrör från infekterade djur eller icke-överförbara celler. Ursprungligen användes fluorescerande VACVs för enkel subcellulär spårning av virusrörelse30, men nyare metoder har utökat sitt användbarhet till att omfatta FRET-studier31,FRAP vid enstaka viruspartiklar32, promotorreportrar33, intravital avbildning34och strukturellastudier 35-37. Alla dessa tekniker kan vara inom enklare och närmare räckvidd i kombination med denna metod för att skapa rekombinanta fluorescerande virus.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av Australian Research Council Federation Discovery Project grant #1096623.
Mycophenolic acid | Sigma-Aldrich | M3536-50MG | Dissolve in 0.1N NaOH |
Xanthine | Sigma-Aldrich | X0626-5G | Dissolve in 0.1N NaoH |
FuGENE HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002 | Olympus, Chroma | BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma) |