حقن النظامية من الخلايا الجذعية العصبية / السلف في الفئران مع EAE المزمن
Summary
زرع الخلايا الجذعية / السلف العصبية (الشخصيات) يحمل وعودا كبيرة في الأعصاب التجدد. تحولت تسليم النظامية من الشخصيات في انخفاض الغازية، وعلاجية فعالة جدا بروتوكول فعالة، لتقديم الخلايا الجذعية في الدماغ والحبل الشوكي من القوارض والرئيسيات غير البشرية تتأثر التجريبية الضرر التهابات مزمنة في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
الخلايا الجذعية / العصبية السلائف (الشخصيات) هي مصدر الخلايا الجذعية واعدة للمناهج تهدف إلى زرع إصلاح الدماغ أو ترميم الأعصاب في التجدد. وقد نشأ هذا التوجيه من الأدلة الوفيرة على أن يتحقق إصلاح الدماغ بعد تنسيق أو النظامية زرع مجلس الشعب في العديد من النماذج قبل السريرية للأمراض العصبية.
وقد حددت هذه البيانات التجريبية الطريق تسليم خلية واحدة من العقبات الرئيسية لالتصالحية العلاج بالخلايا الجذعية لأمراض الدماغ التي تتطلب تقييم عاجلة. يمثل Intraparenchymal ترقيع الخلايا الجذعية نهج منطقي لتلك الأمراض التي تتميز آفات الدماغ معزولة ويمكن الوصول إليها مثل إصابات الحبل الشوكي ومرض باركنسون. للأسف، وهذا المبدأ ينطبق بشكل سيئ لظروف تتميز الطبيعة متعددة البؤر، التهابات ونشرها (سواء في الزمان والمكان)، بما في ذلك مرض التصلب المتعدد (MS). على هذا النحو، الدماغ استهداف SYSTأصبح EMIC تسليم مجلس الشعب منخفض بروتوكول الغازية وفعالة علاجيا لتقديم الخلايا إلى الدماغ والحبل الشوكي من القوارض والرئيسيات غير البشرية تتأثر التجريبية الضرر التهابات مزمنة في الجهاز العصبي المركزي (CNS).
هذه الطريقة بديل من تسليم خلية يعتمد على توجه للنسيج المريض مجلس الشعب، وتحديدا القدرة الفطرية ل(ط) بمعنى البيئة وظيفية عبر جزيئات التصاق الخلية وخلوى وchemokine مستقبلات التهابات؛ (ب) عبور الحواجز التشريحية تسرب بعد الوريد (رابعا) أو intracerebroventricular (ICV) الحقن؛ (ج) تتراكم على مستوى الموقع حول الوعاء متعددة (ق) من التهابات الدماغ والنخاع الشوكي الضرر؛ و (iv) ممارسة التغذية الأنسجة ملحوظا والآثار التنظيمية المناعة على الخلايا المستهدفة المضيف مختلفة في الجسم الحي.
نحن هنا وصف الطرق التي قمنا بتطويرها لد. و<م> تسليم ICV من الشخصيات مسانج في الفئران مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE)، ونموذج من الجهاز العصبي المركزي إزالة الميالين المزمن التهابات، وتتوخى تسليم خلية جذعية النظامية كأسلوب قيمة لاستهداف انتقائي من الدماغ ملتهبة في علم الأعصاب التجدد.
Introduction
نشأت أدلة قوية مستمدة من الدراسات المجراة مما يدل على الكفاءة العلاجية من زرع الخلايا الجذعية العصبية الجسدية / السلائف (الشخصيات) في النماذج الحيوانية من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي 1-8. ومع ذلك، هناك عدد من القضايا المتعلقة إيصال الخلايا الجذعية إلى المضيف تتطلب دراسة متأنية قبل أن تترجم هذه النتائج التجريبية في التطبيقات السريرية. وهناك عقبة كبيرة لا سيما من أجل وضع (nonhematopoietic) التصالحية العلاج بالخلايا الجذعية لمتعددة البؤر، أمراض الدماغ المزمنة التهابات هو تحديد الطريق الأمثل لحقن مجلس الشعب. فهم شركة الفيزيولوجيا المرضية للمرض المستهدفة (تنسيق أو متعددة البؤر؛ الأولية التنكسية التهابات أو الأساسي)، وتحليل حذرا من القضايا الجدوى والمخاطر المرتبطة التقنيات تسليم في تحديد البروتوكول الأمثل للتسليم الخلايا الجذعية.
في حين أن التنسيق ( <em> على سبيل المثال. في لحمة الجهاز العصبي) زرع الخلايا الجذعية هو نهج منطقي لعلاج أمراض الجهاز العصبي المركزي تتميز المناطق المحصورة مكانيا من الضرر (مثل الشلل الرعاش ومرض هنتنغتون، والمخ والحبل الشوكي الإصابات، والسكتة الدماغية)، نفس النهج جدا قد يثبت أن يكون عمليا غير مجدية في ظروف مثل MS، حيث متعددة البؤر، المزمنة، ونشرها مكانيا ضرر CNS يتراكم مع مرور الوقت. في هذه الحالة الأخيرة، التي تستهدف حقن الخلايا تنسيق لآفات الفردية وأعاقت أيضا القدرة محدود من الشخصيات المزروعة على الهجرة لمسافات طويلة داخل لحمة الجهاز العصبي المركزي، مما أثار تحديد طرق بديلة، وأكثر مناسبة من الجهاز العصبي المركزي التي تستهدف زرع مع مجلس الشعب أقل الغازية .
ظهرت عدا كبيرا من الملاحظات التي الشخصيات استهداف الورم داخل القحف (على سبيل المثال. دبقي) في الفئران عندما تم حقنها intravascularly خارج CNS9. تتبع هذا المنويةفي الجسم الحي من الأدلة pathotrophism الخلايا الجذعية 10، وقد تراكمت البيانات واسعة النطاق تتعلق الجدوى والنجاعة العلاجية للزرع النظامية من الشخصيات في الحيوانات المختبرية مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية (EAE)، كنموذج للالتهابات الضرر العصبي المركزي، إما عن طريق الوريد (د) أو intracerebroventricular (ICV). مجلس الشعب حقن 1،2،5،6،8 .. لقد عرض لأول مرة أن هذا يعتمد على القدرة على زرع لاستهداف الشخصيات وأدخل CNS ملتهبة، والدخول في وقت لاحق بين الخلايا متعددة برامج الاتصالات داخل microenvironments محددة في الجسم الحي 11. من أجل خصيصا لاستهداف الجهاز العصبي المركزي، ويتم تسليمها الشخصيات مباشرة في السائل النخاعي (CSF) الدورة الدموية عن طريق الحقن ICV، أو في مجرى الدم عن طريق الحقن د. مرة واحدة إما دخول مجرى الدم أو السائل النخاعي، الشخصيات زرع تتفاعل بنشاط معوالدم في الدماغ (BBB) أو الدم السائل النخاعي (BCSFB) الحواجز وأدخل حمة الجهاز العصبي المركزي. وينظم هذا التفاعل بين مجلس الشعب والكسب غير المشروع BBB (أو BCSFB) من خلال مجموعة محددة من سطح مجلس الشعب جزيئات التصاق الخلية (الحدب) ويسر عن طريق التعبير عن مستويات عالية من CAM مكافحة بروابط على تنشيط البطانية / خلايا البطانة العصبية 12-14. أمثلة من هذه الحدب تشمل مستقبلات للهيالورونات، CD44، وجزيء التصاق بين الخلايا (ICAM) -1 يجند في وقت متأخر جدا المستضد (VLA) -4 5،15،16 (أنه في الكريات البيض، هي المسؤولة عن التفاعل مع البطانة العصبية تفعيلها والخلايا البطانية)، وإلى حد أقل بكثير اللمفاويات وظيفة المرتبطة مستضد (LFA) -1 و ف selectin بروتين سكري يجند (PSGL) -1. الشخصيات أيضا أن أعرب عن مجموعة واسعة من المستقبلات chemokine، بما في ذلك CCR1، CCR2، CCR5، CXCR3، وCXCR4 (ولكن لا تعبر عن CCR3 وCCR7)، والتي هي وظيفيا نشطة، سواء في المختبر والمجراة 5،16. وبالتالي، systemicaالشخصيات حقن LLY استخدام هذه الحدب، جنبا إلى جنب مع G-مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs)، لتتراكم على مستوى الجهاز العصبي المركزي ملتهبة. على العكس، حقن الشخصيات بشكل منتظم في الفئران صحية لا تدخل الجهاز العصبي المركزي عن طريق الأوعية الدموية أو المسارات الفضاء السائل النخاعي 2. CNS التهاب، أو البطانية / تنشيط الخلايا البطانة العصبية التالية خلوى النظامية أو lypopolisaccharide (LPS) حقن كنموذج للالتهاب الدماغ الناجم عن كيميائيا، لذا فمن الضروري لتراكم الشخصيات حقن منتظم في الدماغ والحبل الشوكي 2. وبالتالي، والاستهداف الناجح لCNS مع العلاجات مجلس الشعب النظامية تعتمد على تحديد نافذة معينة المرض الفرص (وو) التي الدماغ والحبل الشوكي بيئة تفضي إلى تراكم والهجرة transendothelial من الشخصيات. تنشأ مثل هذه الظروف عادة في سياق الحاد وتحت الحاد التهاب 17. مرة واحدة بعد أن دخلت الجهاز العصبي المركزي، زرع الشخصيات غير متمايزةوقد تبين لتحسين ميزات الممارسة الطبية السريرية المرضية من الفئران وكذلك أكبر، الرئيسيات غير البشرية مع EAE. وقد وصفت هذه أن تعتمد الحد الأدنى من استبدال الخلايا وإفراز 2 ملحوظا من عوامل المناعة نظير الصماوي التنظيمية واعصاب داخل الجهاز العصبي المركزي حول الوعاء 2،5،6،18 مقابل غير CNS المناطق الملتهبة 19،20 (مثل العقد الليمفاوية) في استجابة لل إشارة الخلية التهابات التي تسببها تسلل الخلايا المناعية 5.
هنا نحن تصف الجوانب المنهجية الأساسية لحقن النظامية من الشخصيات الجسدية في نموذج الفأر من EAE المزمن. وبشكل أكثر تحديدا، يمكننا تعريف البروتوكولات التي وضعناها ل(ط) اشتقاق، وتوسيع والاستعداد لزرع الشخصيات الجسدية من منطقة subventricular (SVZ) من الكبار C57BL / 6 الفئران؛ (ب) لحث على EAE المزمنة في مثل الفئران و (iii) أداء فعالة علاجيا النظامية (في الوريد أو ICV) ط زرع مجلس الشعبn لالفئران EAE.
Protocol
Representative Results
Discussion
العلاج بالخلايا الجذعية الجسدية ومقرها الناشئة باعتبارها واحدة من أهم الاستراتيجيات الواعدة لعلاج الاضطرابات الالتهابية المزمنة CNS مثل MS2 11. في حين أن آليات الحفاظ على آثارها العلاجية لا تزال بحاجة إلى توضيح تماما، ونظرا لتأثير كبير من زرع مجلس الشعب في نماذج …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر جايدن سميث لاستعراض نقدي وإثبات تحرير المخطوطة. وقد تلقى هذا العمل دعما من الجمعية الوطنية التصلب المتعدد (NMSS والمنح الجزئية RG-4001-A1)، والإيطالية جمعية التصلب المتعدد (AISM، منح 2010/R/31)، وزارة الصحة الإيطالية (GR08-7)، أجنحة من أجل الحياة، بنكا بوبولاري اجريكولا دي راغوزا (BAPR)، ومجلس البحوث الأوروبي (ERC) بموجب اتفاق ERC-2010-جنيها استرلينيا أي برنامج المنح الإطار 7 الجماعة الأوروبية (EC) 260511-SEM_SEM و(FP7/2007-2013) تحت اتفاقية المنحة ن * درجة؛ 280772 – حصرى.
Materials
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | SIGMA-ALDRICH CO LTD | C7352 | |
| Papain | WORTHINGTON | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem cell technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca& Mg | PAA LABORATORIES LTD | H15-011 | |
| Myco trace | PAA LABORATORIES LTD | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | |
| immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA LABORATORIES LTD | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | SIGMA-ALDRICH CO LTD | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | SIGMA-ALDRICH CO LTD | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tolls | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tolls | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SIGMA | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | vector laboratories | PK-6100 |
Riferimenti
- Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
- Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
- Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
- Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
- Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
- Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
- Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
- Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
- Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
- Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
- Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
- Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
- Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
- Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
- Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
- Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
- Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
- Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
- Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
- Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
- Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
- Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
- Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).
