Iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con EAE cronica
Summary
Il trapianto di cellule staminali / progenitrici neurali (NPC) detiene grandi promesse in neurologia rigenerativa. La consegna sistematica di NPC è trasformato in efficace protocollo, bassa invasività, e terapeuticamente molto efficace per fornire cellule staminali nel cervello e nel midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale.
Abstract
Cellule staminali / precursori neurali (NPC) sono una fonte di cellule staminali promettente per gli approcci di trapianto finalizzate alla riparazione del cervello o il ripristino in neurologia rigenerativa. Questa direttiva è nata dalla vasta evidenza che la riparazione del cervello è ottenuta dopo trapianto NPC focale o sistemica in diversi modelli preclinici di malattie neurologiche.
Questi dati sperimentali hanno identificato il percorso di consegna cellula come uno dei principali ostacoli di terapie con cellule staminali rigeneranti per le malattie cerebrali che richiede una valutazione urgente. Intraparenchimale trapianto di cellule staminali rappresenta un approccio logico per quelle patologie caratterizzate da isolate e accessibili lesioni cerebrali, quali lesioni del midollo spinale e la malattia di Parkinson. Purtroppo, questo principio è poco applicabile a condizioni caratterizzate da una natura multifocale, infiammatoria e diffusi (sia nel tempo e nello spazio), tra cui la sclerosi multipla (SM). Come tale, il cervello targeting systconsegna NPC emic è diventato un protocollo bassa invasività e terapeuticamente efficace per fornire cellule al cervello e il midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale (CNS).
Questo metodo alternativo di consegna delle cellule si basa sul pathotropism NPC, in particolare la loro capacità innata di (i) percepire l'ambiente tramite molecole di adesione cellulare funzionali e citochine e chemochine recettori infiammatori; (Ii) attraversare le perdite barriere anatomiche dopo per via endovenosa (IV). O intracerebroventricolare (ICV) di iniezione; (Iii) accumulare a livello del sito multiplo perivascolare (s), del cervello e del midollo spinale danno infiammatorio; e (iv) esercitare notevole trofico tissutale e effetti regolatori immunitari su diverse cellule bersaglio ospitante in vivo.
Qui si descrivono i metodi che abbiamo sviluppato per il iv. e <em> consegna ICV di NPC singeniche in topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), come modello di demielinizzazione infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale, e prevedono la consegna delle cellule staminali sistemico come una tecnica preziosa per targeting selettiva del cervello infiammato in neurologia rigenerativa.
Introduction
Forte evidenza è sorta da studi in vivo che attestano l'efficacia terapeutica del trapianto di cellule somatiche neurali staminali / precursori (NPC) in modelli animali di disturbi al SNC 1-8. Tuttavia, una serie di questioni relative alla fornitura di cellule staminali nel ospitante richiede un attento esame prima che questi risultati sperimentali possono essere tradotti in applicazioni cliniche. Un ostacolo particolarmente significativo verso lo sviluppo di (ematopoietiche) terapie con cellule staminali rigeneranti per multifocali, malattie infiammatorie cerebrali croniche è l'identificazione del percorso ideale di iniezione NPC. Una solida comprensione della fisiopatologia della malattia mirata (focale o multifocale; degenerativa infiammatoria o primaria primaria), ed un'analisi prudente di questioni di fattibilità e di rischio associati alle tecniche di spedizione sono a individuare il protocollo ottimale per la consegna delle cellule staminali.
Mentre la focale ( <em> Ad es. nel parenchima sistema nervoso) trapianto di cellule staminali è un approccio logico per il trattamento di malattie del SNC caratterizzate da aree spazialmente confinate di danno (ad es Parkinson e la malattia di Huntington, cervello e midollo spinale lesioni traumatiche, e ictus), lo stesso approccio può rivelarsi che sia praticamente non realizzabile in condizioni come la sclerosi multipla, in cui un multifocale, cronica, e spazialmente diffusi danni CNS accumula nel tempo. In quest'ultimo caso, il targeting iniezioni di cellule focali di singole lesioni è inoltre ostacolato dalla limitata capacità di NPC trapiantate per migrare su lunghe distanze all'interno del parenchima nervoso centrale, inducendo quindi l'individuazione di metodi più idonei alternativi di CNS targeting con trapianti NPC meno invasive .
Grande promessa emerso dalle osservazioni che NPC colpiscono un tumore intracranico (ad es. Glioma) nei topi quando iniettato per via endovenosa al di fuori del CNS9. Seguendo questa seminaleevidenza in vivo di cellule staminali pathotrophism 10, numerosi dati sono stati accumulati relativi alla fattibilità e l'efficacia terapeutica del trapianto sistemico di NPC in animali da laboratorio con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello di danno infiammatorio del SNC, sia via endovenosa (iv) o intracerebroventricolare (ICV). NPC iniezione 1,2,5,6,8 .. Abbiamo prima dimostrato che questo dipende dalla capacità di NPC trapiantate per indirizzare e inserire il SNC infiammato, e di impegnarsi in seguito intercellulare multipla programmi di comunicazione all'interno di microambienti particolari in vivo 11. Al fine di indirizzare specificamente il CNS, NPC vengono consegnati direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF) circolazione mediante iniezione ICV, o nel flusso sanguigno tramite iniezione endovenosa. Una volta immettendo nel flusso sanguigno o CSF, NPC trapiantate interagiscono attivamente conil cervello di sangue (BBB) o di sangue nel liquido cerebrospinale (BCSFB) le barriere e inserire il parenchima del SNC. Questa interazione tra l'innesto NPC e il BBB (o BCSFB) è regolata da specifica serie di molecole di adesione cellulare di superficie NPC (CAM) e facilitato dalla espressione di elevati livelli di CAM contro-ligandi sulla attivati endoteliali / cellule ependimali 12-14. Esempi di queste camme includono il recettore per ialuronato, CD44, e la molecola di adesione intercellulare (ICAM) -1 ligando molto tardi antigene (VLA) -4 5,15,16 (che, nei leucociti, sono responsabili dell'interazione con ependimali attivato e cellule endoteliali), e di un linfocita misura Function-associated Antigen molto più basso (LFA) -1 e P-selectina ligando glicoproteina (PSGL) -1. NPC esprimono anche una vasta gamma di recettori per chemochine, tra cui CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 e CXCR4 (ma non esprimono CCR3 e CCR7), che sono funzionalmente attivi, sia in vitro che in vivo 5,16. Così, systemicaNPC lly iniettati utilizzano queste camme, insieme a G-proteina recettore accoppiato (GPCR), ad accumularsi a livello del SNC infiammato. Al contrario, PNG iniettato per via sistemica in topi sani non entrare SNC via vascolare o cerebrospinale aeree spazio fluido 2. CNS infiammazione, o endoteliale / attivazione delle cellule ependimali seguente citochine sistemica o lypopolisaccharide (LPS) iniezione come modello di encefalite indotta chimicamente, è pertanto necessario per l'accumulo di NPC sistematicamente iniettate nel cervello e nel midollo spinale 2. Così, il targeting successo del SNC con terapie sistemiche NPC dipende dalla identificazione di una finestra specifica malattia di opportunità (woo) in cui il cervello e del midollo spinale ambiente favoriscono l'accumulo e la migrazione transendoteliale di NPC. Tali condizioni generalmente sorgono nel contesto di infiammazione acuta e subacuta 17. Dopo aver inserito il sistema nervoso centrale, trapiantato NPC indifferenziatihanno dimostrato di migliorare le caratteristiche clinico-patologiche di topi e anche più grandi, primati non umani con EAE. Questo è stato descritto a dipendere da minimal sostituzione cella 2 e notevole secrezione di fattori immunitari paracrini regolamentari e neuroprotettivi all'interno perivascolare CNS 2,5,6,18 vs non-SNC zone infiammate 19,20 (ad esempio linfonodi) in risposta alla segnalazione di cellule infiammatorie suscitato infiltrandosi cellule immunitarie 5.
Qui descriviamo gli aspetti chiave metodologici della iniezione sistemica di NPC somatiche in un modello murino di EAE cronica. Più in particolare, si definiscono i protocolli che abbiamo stabilito a (i) Derive, espandere e prepararsi per trapianto NPC somatici dalla zona subventricolare (SVZ) di adulti C57BL / 6 topi; (Ii) indurre EAE cronica in questi topi e (iii) effettuare terapeuticamente efficace sistemica (iv o ICV) trapianto NPC itopi nto EAE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terapie basate sulle cellule staminali somatiche stanno emergendo come una delle strategie più promettenti per il trattamento di malattie croniche infiammatorie del sistema nervoso centrale come MS2 11. Mentre i meccanismi che sostengono i loro effetti terapeutici devono ancora essere completamente chiarito, l'impatto significativo della NPC trapianto in diversi modelli sperimentali di malattie neurodegenerative ha dato origine alla credenza un po 'provocatorio che le cellule staminali potrebbero pre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Jayden Smith per la revisione critica e la modifica prova del manoscritto. Questo lavoro ha ricevuto il sostegno della National Multiple Sclerosis Society (NMSS, borse di studio parziali RG-4001-A1), l'Associazione Italiana Sclerosi Multipla (AISM, concedere 2010/R/31), il Ministero della Salute italiano (GR08-7), Wings for Life, la Banca Agricola Popolare di Ragusa (BAPr), il Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito dell'accordo ERC-2010-StG di Grant no 260.511-SEM_SEM e 7 ° Programma quadro della Comunità europea (CE) (FP7/2007-2013) ai sensi della convenzione di sovvenzione n * deg; 280.772 – Ione.
Materials
| Cell culture | |||
| EBSS | Sigma | E2888 | |
| L-Cystein | SIGMA-ALDRICH CO LTD | C7352 | |
| Papain | WORTHINGTON | 30H11965 | |
| EDTA | Fisher scientific | D/0700/50 | |
| Mouse NeuroCult basal medium | Stem Cell technologies | 05700 | |
| NeuroCult proliferation supplements | Stem Cell technologies | 05701 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| Basic fibroblast growth factor | Peprotech | 100-18B-1000 | |
| Epidermal growth factor | Peprotech | AF-100-15-1000 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 1514012 | |
| Matrigel (coating solution) | BD biosciences | 354230 | |
| NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse) | Stem cell technologies | 05704 | |
| Accumax | eBioscience | 00-4666-56 | |
| Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca& Mg | PAA LABORATORIES LTD | H15-011 | |
| Myco trace | PAA LABORATORIES LTD | Q052-020 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | |
| immunofluorescence | |||
| Normal goat serum | PAA LABORATORIES LTD | B11-035 | |
| Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether | SIGMA-ALDRICH CO LTD | T8787 | |
| Mouse anti Nestin | Abcam | ab11306 | |
| Rabbit anti GFAP | DAKO | 203344 | |
| Mouse anti Histone H3 (phospho S10) | Abcam | ab14955 | |
| Rabbit anti MAP-2 | Abcam | ab32454 | |
| Rat anti MBP | AbD SEROTEC | MCA409S | |
| Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345 | Millipore | MAB345 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting solution | DAKO | S3023 | |
| EAE | |||
| Freund's Adjuvant Incomplete | SIGMA-ALDRICH CO LTD | F5506 | |
| Mycobacterium tuberculosis | DIFCO | H37Ra | |
| MOG(35–55) | Espikem | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories | 181 | |
| Tissue processing | |||
| Iris scissor straight | Fine Sciences Tolls | 14060-09 | |
| Blunt/bended forceps | Fine Sciences Tolls | 11080-02 | |
| Brain slicer | Zivic instruments | BSMAS005-1 | |
| Surgical blades | Swann-Morton | 324 | |
| P200, P1000 pipettes | |||
| Ketamine (Vetalar) | Boehringer Ingelheim | 01LC0030 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 32371 | |
| Stereotaxic frame | KOPF | Model 900 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7762-04 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SIGMA | 158127 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit | vector laboratories | PK-6100 |
Riferimenti
- Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
- Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
- Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
- Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
- Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
- Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
- Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
- Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
- Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
- Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
- Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
- Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
- Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
- Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
- Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
- Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
- Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
- Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
- Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
- Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
- Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
- Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
- Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
- Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).
