وهناك طريقة الهطول معدلة لعزل البولية Exosomes
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
exosomes البولية هي الحويصلات الداخلية صغيرة من 100 نيوتن متر من الهيئات عديد الحويصلات (MVB) المستمدة من جميع أنواع الخلايا تحت الظروف العادية والمرضية في الفضاء البولية بما في ذلك podocytes الكبيبي، وخلايا النبيبات الكلوية والخلايا المبطنة للشبكات الصرف البولية التي يبدو أنها المخصب لmiRNAs 1 -2. وقد كشفت العديد من الباحثين البروتينات متميزة في exosomes معزولة عن البول الأفراد الأصحاء وكذلك مع كلوي و / أو الأمراض منهجية 3-5. Exosomes يمكن عزلها باستخدام طرق مختلفة مثل خطوتين التفاضلي تنبيذ فائق مع أو بدون السكروز 6-7، والجمع بين مرشح nanomembrane مع تنبيذ فائق 8-9، أو هطول الأمطار 10-11. لقد وضعت مؤخرا طريقة بسيطة وسريعة وقابلة للتطوير وفعال لعزل exosomes البولية وكشف ميرنا ومؤشرات حيوية البروتين 11. على الرغم من أن المؤشرات الحيوية يمكن اكتشافه في مجموعة متنوعة من السوائل البيولوجية المختلفة، اورالمعهد الوطني للإحصاء هو الخيار الأكثر ملاءمة للمرضى الذين يعانون أمراض الكلى والمسالك البولية لأنه يمكن الحصول على كميات كبيرة بطريقة نسبيا غير الغازية.
على الرغم من أن هناك عدة طرق لعزل exosomes البولية 6-11، فإن الإجراء الأكثر شيوعا يعتمد على تنبيذ فائق التفاضلي مع وسادة السكروز 30٪. في حين أن هذا الأسلوب هو كفاءة وجودة exosomes الناتجة معزولة مع هذا الإجراء عالية، وأسلوب في حد ذاته يتطلب الموظفين المهرة وهي، والتي تتطلب العديد من الخطوات تنبيذ فائق تستغرق وقتا طويلا. أساليب أخرى، مثل الترشيح وهطول الأمطار، وقد وضعت لعزل exosomes، بما في ذلك واحد يستخدم الملكية هطول الأمطار كاشف (أي ExoQuick-TC: نظام العلوم البيولوجية، ماونتن فيو، كاليفورنيا). وعلى الرغم من هطول الأمطار باستخدام هذا كاشف بشكل سريع وسهل نسبيا، ونقاء exosomes معزولة منخفض بالمقارنة مع المنهجيات تنبيذ فائقالتطوير التنظيمي. ونحن مؤخرا مقابل ستة طرق لعزل exosomes البولية، بما في ذلك تعديل طريقة الترسيب باستخدام ExoQuick-TC التي قمنا بتطويرها في مختبرنا 11. وجدنا أن هذه الأمطار طريقة تعديل أثمرت كميات أكبر من البروتين، ميرنا، ومن mRNAs والإجراء نفسه كان أسرع وأسهل للتنفيذ من تنبيذ فائق. هنا، نحن تصف بروتوكول تجريبي لدينا هطول طريقة تعديلها بطريقة تدريجية، وتشمل مناقشة مزايا وعيوب هذه التقنية مقارنة مع غيرها من أساليب exosome العزلة. ويشمل هطول الأمطار على طريقة تعديل الأولي من الجسيمات exosome، تليها إزالة البروتين تام-هورسفال، الذي يرتبط مع بروتينات exosomal، والمعروف للحد من العائد exosome من البول. وجدنا أن هذه التعديلات زيادة المحصول ونقاء إعداد exosomal من البول.
Protocol
Representative Results
Discussion
معظم الطرق التي تنطوي على ترسيب exosomes من البول لا تعالج إزالة شبكة البوليمرية التي شكلتها البروتين تام-هورسفال (THP). هذا البروتين موجود في كميات كبيرة في البول، حيث exosomes أنه الفخاخ مزعومة أثناء الأولي الطرد المركزي بسرعة منخفضة. في أسلوبنا تعديل خفضنا THP باستخدام DTT قبل…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
Riferimenti
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
