En modifierad Nederbörd Metod för att isolera Urin exosomes
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
Urin exosomes är små interna blåsor på 100 nm av multivesikulära organ (MVB) härrör från alla celltyper under normala och sjukliga tillstånd i urin utrymme inklusive glomerulära podocyter, njur tubuliceller och celler som kantar urin dräneringssystem som verkar vara berikad för miRNA en -2. Många forskare har upptäckt distinkta proteiner i exosomes isolerade från urin hos friska individer samt de med nedsatt njur- och / eller systematiska sjukdomar 3-5. Exosomes kan isoleras med hjälp av olika metoder såsom tvåstegs differentiell ultracentrifuge med eller utan sackaros 6-7, kombinerar nanomembrane filter med ultracentrifuge 8-9, eller nederbörd 10-11. Vi har nyligen utvecklat en enkel, snabb, skalbar och effektiv metod för att isolera urin exosomes och upptäcka miRNA och protein biomarkörer 11. Även biomarkörer kan detekteras på en mängd olika biologiska vätskor, URine är det mest praktiska valet för patienter med sjukdomar i njurar och urinvägar eftersom det kan erhållas i stora mängder i en relativt icke-invasivt sätt.
Även om det finns flera metoder för att isolera urin exosomes 6-11, den vanligaste förfarande baseras på differential ultracentrifuge med en 30% sackaroskudde. Även om denna metod är effektiv och kvaliteten på de resulterande exosomes isolerade med detta förfarande är hög, tekniken i sig kräver kompetent personal och är tidskrävande, kräver flera ultracentrifugeringssteg. Andra metoder, såsom filtrering och nederbörd, har utvecklats för isolering av exosomer, inklusive en som använder ett eget utfällningsreagens (dvs ExoQuick-TC: System Biosciences, Mountain View, CA). Även nederbörd använda denna reagens är snabb och relativt lätt, är renheten av exosomes isolerade låg jämfört med ultracentrifuge methOD. Vi har nyligen jämfört sex metoder för isolering av urin exosomer, bland annat en modifiering av fällningsmetod som använder ExoQuick-TC som vi utvecklat i vårt laboratorium 11. Vi fann att denna modifierade utfällningsmetoden gav högre mängder protein, miRNA och mRNA och själva förfarandet var snabbare och enklare att genomföra än ultracentrifuge. Här beskriver vi den experimentella protokollet av vår modifierade utfällningsmetoden stegvis, och innehålla en diskussion om för- och nackdelar med denna teknik jämfört med andra metoder för Exosome isolering. Den modifierade utfällningsmetoden involverar en initial utfällning av Exosome partiklar, följt av avlägsnande av Tamm-Horsfall protein, som är korrelerad med exosomal proteiner, och känt för att reducera Exosome utbyte från urin. Vi fann att dessa modifieringar ökar utbytet och renheten av exosomal beredning från urin.
Protocol
Representative Results
Discussion
De flesta metoder som involverar utfällning av exosomer från urin behandlas inte avlägsnande av polymera nätverk som bildas av Tamm-Horsfall protein (THP). Detta protein finns i stora mängder i urinen, där den förmodat fällor exosomer under inledande låghastighetscentrifugering. I vår modifierad metod minskade vi THP använder DTT före Exosome nederbörd. Såsom visas i fig 2, observerades en högre mängd av THP observerats i obearbetat urin och pelleten, med ingen THP i den slutliga superna…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
Riferimenti
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
