Методы количественного определения антител-индуцированной активации комплемента по ЭРИТРОЦИТОВ
Summary
Здесь мы опишем два анализы для измерения активации комплемента, вызванное антителами против красных кровяных клеток. Основным преимуществом над текущими анализов является их количественный и природа простой в интерпретации.
Abstract
Антитела против красных кровяных телец (эритроцитов) может привести к активации комплемента, что приводит к ускоренному оформлению через рецепторы комплемента в печени (внесосудистая гемолиз) или приводит к внутрисосудистого лизиса эритроцитов. Аллоантител (например АВО) или аутоантител к антигенам эритроцитов (как видно на аутоиммунной гемолитической анемии, АМСЗ), ведущие к активации комплемента потенциально вредны и могут быть – особенно, когда приводит к внутрисосудистого лизиса – со смертельным исходом 1. В настоящее время, активацию комплемента вследствие (авто)-антител на эритроцитах оценивается в пробирке с помощью тест Кумбса, отражающий отложение комплемента на РБК или с помощью неколичественные гемолитической анализа отражающей РБК лизиса 1-4. Тем не менее, для оценки эффективности ингибиторов комплемента, то в обязательном порядке иметь количественные методы. Здесь мы опишем два таких методов. Во-первых, анализ, чтобы обнаружить C3 и отложение C4 на красных кровяных телец, который, вызванных антител в сыворотке пациента предварительнозаслушанных. Для этого анализа FACS используется с флуоресцентно меченных анти-С3 или С4 анти-антител. Далее, количественный гемолитическая анализ описан. В этом анализе комплемент-опосредованной гемолиз, индуцированный сыворотки пациента измеряется с использованием спектрофотометрического обнаружения опубликованном гемоглобина. Оба этих анализов очень воспроизводимым и количественный, что облегчает изучение активации комплемента антитело-индуцированный.
Introduction
Антитела против красных кровяных телец (эритроцитов) может быть вызвана при переливании эритроцитов, экспрессирующих антиген, которого нет на БС-получателей. Эти алло-антитела могут вызывать тяжелые острые гемолитические реакции переливания из-за активации комплемента на следующем переливании 5. В аутоиммунного гемолитической анемии (АМСЗ), пациенты имеют аутоантитела против собственного эритроцитов. Это приводит к ускоренному оформлению клеток через взаимодействие IgG, связанного с эритроцитов с Fcγ-рецепторами на фагоцитов в селезенке и / или в случае аутоантител, способных активировать комплемент через рецепторы комплемента в печени 6,7. Активация Молниеносный дополнением в результате внутрисосудистого гемолиза является редким, но нередко приводит к смерти. Ускоренное, опосредованное комплементом разрушение РБК, вызванное либо алло-или аутоантител приводит к острой анемии и, следовательно, потенциально смертельной тканевой гипоксии. В авто-антител в AIHA классифицируются в теплых и холодных антител, dependinг на оптимальной температуре они связываются с эритроцитами (37 ° С или ниже, соответственно). Теплые антитела, как правило, из IgG изотипа и холодные антитела по изотип IgM 8,9. АМСЗ может быть вторичной по отношению к например lymphoprolyferative расстройств, заболеваний соединительной ткани, солидных опухолей, инфекций или наркотиков, но в 50% случаев АМСЗ идиопатический 9.
Обнаружение gammaglobulins (например. IgG или IgM) и дополняют привязан к эритроцитов пациента осуществляется с помощью полуколичественного прямого антиглобулиновый тест (Кумбса) (DAT). В DAT эритроциты пациента инкубируют с анти-IgG или анти-c3d. Появление РБК агглютинации демонстрирует наличие прикрепленных компонентов комплемента или связывание IgG. Обнаружение алло-или аутоантител в сыворотке пациента осуществляется с помощью теста косвенного антиглобулиновой (IAT). В IAT, бромелайн, обработанных испытаний эритроцитов инкубировали с сывороткой пациента, промывали и затем инкубировали с анти-чУмань IgG. В случае эритроциты имели возможность ознакомиться с настоящим анти-РБК IgG в сыворотке пациента агглютинации произойдет. IgM антитела к эритроцитов приведет непосредственно к агглютинации при инкубации бромелайна обработанных испытательных эритроцитов с сывороткой пациента. RBC агглютинации в прямой тест Кумбса или в IAT оценивали визуально либо на глаз в пробирке или путем загрузки образца на небольшую колонку Sephadex разделяющей агглютинируются и единичные эритроциты по размеру 1.
Другой часто используемый метод для измерения активации комплемента на БС является гемолитический анализ 1, в которой емкость сыворотки пациента, чтобы вызвать (опосредованного комплементом) гемолиз бромелайн эритроцитов, обработанных 10 оценивается. Тест отметил как положительные, когда супернатант после центрифугирования окрашивается красным из-за выпущен гемоглобина и считается отрицательным, если он остается бесцветным. Оба теста антиглобулиновый и гемолитическая анализа являются полуколичественная, так как самая высокая Серум разведение обозначается в которой тест по-прежнему положительный.
Тест антиглобулиновый и гемолитическая анализа являются надежные анализы, которые обычно используются в диагностике. Так как эти анализы полуколичественный и зависит от опыта специалиста, выполняющего анализ они не подходят для изучения тонкие различия активации комплемента по эритроцитов, при необходимости при оценке эффективности ингибиторов комплемента. Таким образом, мы разработали два количественных анализов для определения активации комплемента по (авто-) антител к эритроцитов, которые мы опишем в этой статье.
Во-первых, мы разработали анализ для измерения отложение активации фрагментов комплемента С3 и С4 на БС (рис. 1А). В этом анализе человека Bromelain обработанных типа 0 эритроцитов инкубировали с инактивированной нагреванием сыворотки пациента (источник анти-антитело RBC), свежие АВ сыворотки (источника комплемента) и анти-C5 моноклонального антитела (Eculizumab). За это вклubation, С3 и С4 осаждение произойдет, если сыворотка пациента содержит дополнение активации анти-РБК антител. Для того чтобы предотвратить лизис эритроцитов путем активации комплемента ниже по потоку добавлена блокирование анти-C5 моноклональное антитело. Далее, С3 и С4 осаждение на БС обнаруживает FACS с использованием флуоресцентно меченных моноклональных антител или Fab-фрагменты, реагирующие с С3 и С4, соответственно. Память на одной БС важно обеспечить надежность результатов. Преимущества этого метода включают, что небольшой объем материала пациента требуется, активацию комплемента на ранней стадии каскада оценивается и метод воспроизводимым и количественный. Дополнительным преимуществом глядя на обоих C3 и C4 является то, что можно провести различие между классическим и лектинов активации пути (как С3 и С4 осаждения) и активации альтернативного пути (только C3 осаждения). Использование бромелаина эритроцитов, обработанных вместо необработанных эритроцитов повышает чувствительность каксказать.
Второй тест основан на используемой в настоящее время гемолитической анализа (рис. 1В). Человека Бромелайн обращению типа 0 эритроциты инкубируют с инактивированной нагреванием сыворотки пациента (источник анти-РБК антитела) и свежей сывороткой АВ (источник дополнением). Если дополнение активируется пациентов анти-антител RBC, в зависимости от дозы RBC лизис происходит, что приводит к высвобождению гемоглобина. Количество выпущенной гемоглобина количественно путем измерения его абсорбции при 414 нм в супернатанте после летел вниз неповрежденные и фрагментированные эритроциты. Оптическую плотность коррелирует с количеством произошло гемолиза. В отличие от используемого в данный момент анализа, этот протокол позволяет объективно, количественного значения гемолиз, что очень воспроизводимым и не зависит от человека интерпретации анализа.
Применение этих методов было описано в 11, где потенциальное использование С1-ингибитора в качестве ингибитора комплемента в AIHA был ыtudied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вышеуказанные анализы воспроизводимым и надежным. Они легко выполнить и можно выполнять их со многими образцов в то же время (в 96-луночный планшет с). Таким образом, этот подход будет также подходит для полностью автоматизированной системой, например системы робота ELISA. В отличие о?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ и DW получить неограниченный грант ViroPharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
Riferimenti
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
