赤血球上の抗体誘導性補体活性化の定量的検出のための方法
Summary
ここでは、赤血球に対する抗体により誘導される補体活性化を測定するための2つのアッセイを記載する。現在のアッセイ以上の主要な利点は、それらの定量的かつ簡単に解釈する性質である。
Abstract
赤血球（RBC）に対する抗体は、活性化の肝臓における補受容体を介して加速されたクリアランス（血管外溶血）を生じるか、RBCの血管内溶解をもたらすを補完する可能性があります。補体活性化につながる赤血球抗原に対する同種抗体（ 例えば ABO）または自己抗体（自己免疫性溶血性貧血、AIHAに見られるように）潜在的に有害であるとすることができます-血管内溶解をもたらす場合は特に-致命的な1。現在、原因のRBC ON（自動） -抗体に補体活性化は、RBCまたはRBC溶解1-4を反映した非定量溶血アッセイによる補体沈着を反映したクームス試験を使用することにより、in vitroで評価される。しかしながら、補体阻害剤の有効性を評価するためには、定量的な技術を有することが必須である。ここでは、そのような2つの手法を説明します。まず、患者の血清中の抗体により誘導される赤血球上C3及びC4沈着を検出するためのアッセイは、プレsented。このために、FACS分析を蛍光標識した抗C3または抗C4抗体とともに使用される。次に、定量的溶血アッセイが記載されている。このアッセイでは、患者血清により誘導される補体媒介性溶血が放出されたヘモグロビンの分光光度検出を利用して測定される。これらのアッセイの両方が抗体誘導性の補体活性化の研究を容易にする、非常に再現性および定量的である。
Introduction
赤血球（RBC）に対する抗体は、レシピエント赤血球上に存在しない抗原を発現する赤血球の輸血によって誘導することができる。これらのアロ抗体は、以下の輸血5時に補体活性化に起因する重篤な急性溶血性輸血反応を引き起こす可能性があります。自己免疫性溶血性貧血（AIHA）において、患者は、自分自身の赤血球に対する自己抗体を有する。これは、脾臓および/ または肝臓6,7における補体受容体を介して補体を活性化することが自己抗体の場合には食細胞上のFcγ受容体と赤血球に結合したIgGの相互作用を介して細胞の加速クリアランスにつながる。血管内溶血をもたらし劇補体活性化は、稀ではあるが、多くの場合致命的である。加速、急性貧血ので、潜在的に致命的な組織低酸素のいずれかで同種もしくは自己抗体の結果によって誘導された媒介赤血球の破壊を補完します。 AIHAにおける自己抗体はdependin、暖かいと冷たい抗体に分類されている彼らは赤血球（それぞれ37℃以下）に結合し、最適な温度にグラム。暖かい抗体は、IgGアイソタイプおよびIgMアイソタイプ8,9の寒抗体の通常です。 AIHAは例えば lymphoprolyferative疾患、結合組織疾患、固形腫瘍、感染症や薬物への二次的であり得るが、症例の50％においてAIHAは特発9です。
γグロブリン（ 例えば、。のIgGまたはIgM）の検出、患者の赤血球に結合した補体は、半定量的な直接抗グロブリン（クームス）試験（DAT）によって行われる。 DATにおいて、患者RBCは抗IgGまたは抗C3dのとインキュベートする。 RBC凝集の発生が取り付けられ、補体成分の存在を実証またはIgG結合。同種または患者の血清中の自己抗体の検出は、間接抗グロブリン試験（IAT）を用いて行われる。 IATでは、ブロメライン処理した試験RBCは、患者の血清とインキュベートし、洗浄した後、抗HとインキュベートするIgGのUMAN。ケース赤血球に凝集が発生し、患者血清中の抗赤血球に存在するIgGで感作されています。赤血球に対するIgM抗体は、直接患者血清とブロメライン処理した試験RBCのインキュベーションで凝集につながる。直接クームス試験やIATにおける赤血球凝集反応を視覚的に試験管内の目によって、またはサイズ1によって凝集し、単一RBCを分離する小さなセファデックスカラムにサンプルをロードすることによって、どちらかに評価される。
赤血球上の補体活性化を測定するために、別の頻繁に使用される技術は、ブロメライン処理したRBC 10の（補体媒介）溶血を誘発する患者血清の容量が評価された溶血アッセイ1、である。遠心分離後の上清が原因で放出されたヘモグロビンを赤色に染色し、無色のままである場合は負であると考えられる場合に試験が陽性として注目されている。抗グロブリン試験や溶血アッセイの両方が最高出せるので、半定量的であるMの希釈はテストがまだ正である示されている。
抗グロブリン試験や溶血アッセイは、日常の診断に使用されている堅牢なアッセイである。これらのアッセイは、半定量的および補体阻害剤の有効性を評価する際に、必要に応じて、彼らは、赤血球上の補体活性化の微妙な違いを研究するのに適していないアッセイを行う技術者の経験に依存しているので。したがって、我々は我々がこの論文で説明赤血球に（オート）抗体による補体活性化を決定するために、2の定量的アッセイを開発した。
まず、赤血球上の補体C3およびC4の活性化フラグメントの沈着（ 図1A）を測定するためのアッセイを開発した。このアッセイにおいて、ヒトブロメライン処理したタイプ0 RBCは、熱不活性化患者血清（抗RBC抗体源）、新鮮なAB血清（補体源）および抗C5モノクローナル抗体（エクリズマブ）と共にインキュベートする。この社の間に患者血清は抗RBC抗体を活性化補完が含まれている場合ubation、C3、C4の沈着が発生します。下流の補体活性化によりRBC溶解を防ぐために、ブロッキング抗C5モノクローナル抗体が添加される。次に、赤血球上のC3およびC4沈着は、それぞれC3およびC4と反応する蛍光標識されたモノクローナル抗体またはFabフラグメントを用いてFACSによって検出される。単一の赤血球上のゲーティングは、結果の信頼性を確保することが重要である。この技術の利点は、カスケードの初期段階で、補体活性化、患者材料の小さな体積が必要であることを含んで評価し、この方法は、再現可能かつ定量的である。 C3およびC4の両方を見てのさらなる利点は、区別は、古典経路およびレクチン経路の活性化（C3とC4の沈着の両方）および代替経路の活性化（C3のみ堆積）の間に行うことができることである。代わりに、未処理のRBCのブロメライン処理したRBCの使用は、感度を増加させると言う。
第二のアッセイは、現在使用されて溶血アッセイ（ 図1B）に基づいている。ヒトブロメライン処理したタイプ0 RBCは、熱不活性化患者血清（抗RBC抗体源）と新鮮なAB血清（補体源）と共にインキュベートする。補数を患者抗RBC抗体によって活性化されている場合は、用量依存性のRBC溶解は、ヘモグロビンの放出につながるが発生します。放出されたヘモグロビンの量は、無傷の断片化RBCをスピンダウンした後、上清中の414 nmでの吸光度を測定することによって定量化される。吸光度が発生した溶血の量と相関する。現在使用されるアッセイとは対照的に、このプロトコルは、客観的な、非常に再現性およびアッセイの解釈者に依存しない溶血の定量値を可能にします。
これらの方法の適用はAIHAにおける補体阻害剤としてのC1-阻害剤の使用の可能性は11秒であった、に記載されているtudied。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のアッセイは、再現性と堅牢である。それらは、実施が容易であり、それは（96ウェルプレート）で同時に多数のサンプルを用いてそれらを行うことができる。したがって、このアプローチはまた、ELISAロボットシステム、例えば 、完全に自動化されたシステムに適しているであろう。現在使用される技術とは対照的に、これらのアッセイは定量的であり、これは、補体阻害剤の?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZとDWがViropharmaの無制限の助成金を受ける。
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
Riferimenti
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
