Methoden voor de kwantitatieve detectie van antilichaam-geïnduceerde complement activatie op de rode bloedcellen
Summary
Hier beschrijven we twee assays voor het meten van complement activatie geïnduceerd door antilichamen tegen rode bloedcellen. Het grote voordeel boven de huidige assays is de kwantitatieve en eenvoudig te interpreteren natuur.
Abstract
Antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's) kan leiden tot activatie resulteert in een versnelde klaring via complement receptoren in de lever (extravasculaire hemolyse) of tot intravasculaire lysis van erytrocyten vullen. Antistoffen (bijv. ABO) of auto-antilichamen tegen RBC antigenen (zoals in auto-immune hemolytische anemie, AIHA) leidt tot activatie vullen potentieel schadelijk en kan – vooral wanneer die tot intravasculaire lysis – fataal 1. Momenteel vullen wordt geactiveerd door een (auto)-antilichamen op rode bloedcellen wordt beoordeeld in vitro met behulp van de Coombs-test weerspiegelt complement afzetting op RBC of door een nonquantitative hemolytische assay reflecterende RBC lysis 1-4. Echter, om de werkzaamheid van complement-remmers te beoordelen, is het verplicht om kwantitatieve technieken. Hier beschrijven we twee dergelijke technieken. Eerst een test om C3 en C4 depositie detecteren op rode bloedcellen die wordt geïnduceerd door antilichamen in patiëntenserum voorafwoordigd. Hiervoor wordt FACS-analyse gebruikt fluorescent gemerkt anti-C3 of C4 anti-antilichamen. Vervolgens wordt een kwantitatieve hemolytische test beschreven. In deze test, complement-gemedieerde hemolyse geïnduceerd door patiënt serum gemeten te maken van spectrofotometrische detectie van de vrijgekomen hemoglobine. Beide testen zijn zeer reproduceerbaar en kwantitatief, vergemakkelijken studies van antilichamen geïnduceerde complement activatie.
Introduction
Antilichamen tegen rode bloedcellen (RBC's) kan worden geïnduceerd door transfusie van rode bloedcellen een antigeen tot expressie die niet aanwezig ontvanger RBC. Deze allo-antilichamen kunnen ernstige acute hemolytische transfusiereacties als gevolg van activering op de volgende transfusie 5 aanvullen veroorzaken. In auto-immune hemolytische anemie (AIHA), patiënten autoantilichamen tegen hun eigen RBCs. Dit leidt tot versnelde goedkeuring van de cellen via de interactie van IgG gebonden aan RBC met Fcy-receptoren op fagocyten in de milt en / of bij auto-antilichamen kunnen complement via complement receptoren in de lever 6,7 activeren. Fulminante complement activatie resulteert in intravasculaire hemolyse is zeldzaam maar vaak fataal. Versnelde, aanvulling bemiddelde RBC vernietiging veroorzaakt door ofwel allo-of auto-antilichamen resulteert in acute bloedarmoede en dus potentieel fatale weefsel hypoxie. De auto-antilichamen in AIHA worden ingedeeld in warme en koude antilichamen, dependinG op de optimale temperatuur die binden aan RBC (respectievelijk 37 ° C of lager). De warme antilichamen zijn gewoonlijk IgG isotype en de koude antilichamen van het IgM isotype 8,9. AIHA kan secundair aan bijvoorbeeld lymphoprolyferative aandoeningen, bindweefselziekten, vaste tumoren, infecties of drugs, maar in 50% van de gevallen AIHA idiopathisch 9.
Detectie van gammaglobulinen (bijv.. IgG of IgM) en complement gebonden aan RBC patiënt wordt uitgevoerd door middel van een semikwantitatieve directe antiglobulinetest (Coombs test) (DAT). In de DAT patiënt RBC geïncubeerd met anti-IgG of anti-C3d. Het optreden van RBC agglutinatie toont de aanwezigheid van bijgevoegde complement componenten of IgG binding. Detectie van allo-of auto-antilichamen in het serum van de patiënt wordt uitgevoerd door middel van de indirecte antiglobulinetest (IAT). In de IAT, worden-bromelaïne behandeld testen RBC geïncubeerd met patiënt serum, gewassen en vervolgens geïncubeerd met anti-hUman IgG. Indien rode bloedcellen gesensibiliseerd met anti-RBC IgG aanwezig in de patiënt serumagglutinatie optreden. IgM antilichamen tegen RBC zal direct leiden tot agglutinatie na incubatie van bromelaïne behandeld testen RBC met de patiënt serum. RBC agglutinatie in de directe Coombs-test of in de IAT wordt visueel beoordeeld hetzij door oog in een reageerbuis of door het laden van het monster op een kleine Sephadex kolom scheiden geagglutineerde en single RBC op grootte 1.
Een andere vaak gebruikte techniek om complement activatie op RBC meten is de hemolytische test 1, waarbij de capaciteit van patiënt serum (complement gemedieerde) hemolyse van bromelaïne behandelde RBC 10 induceren beoordeeld. De test wordt genoteerd als positief wanneer de bovenstaande vloeistof na centrifugeren rood is gekleurd vanwege vrijgegeven hemoglobine en als negatief beschouwd als het kleurloos blijft. Zowel de antiglobulinetest en de hemolytische assay zijn semi-kwantitatief, omdat de hoogste serum verdunning wordt aangeduid waarin de test is nog steeds positief.
De antiglobulinetest en de hemolytische assay zijn robuust testen die routinematig worden gebruikt in de diagnostiek. Aangezien deze tests zijn semikwantitatieve en afhankelijk van de ervaring van de technicus uitvoeren van de test zij niet geschikt om subtiele verschillen van complement activatie op RBC bestuderen, zoals nodig bij de beoordeling van de effectiviteit van complement inhibitors. Daarom ontwikkelden we twee kwantitatieve bepalingen om het complement activatie te bepalen door het (auto-) antilichamen tegen RBC, die we in dit artikel zal beschrijven.
Eerst, ontwikkelden we een test om de afzetting van activatie van complement fragmenten C3 en C4 op RBC (figuur 1A) te meten. In deze assay worden menselijke bromelaïne behandelde type 0 RBC geïncubeerd met warmte geïnactiveerd serum patiënt (anti-RBC antilichaam bron), vers AB serum (complement bron) en anti-C5 monoklonaal antilichaam (Eculizumab). Tijdens deze incubation, C3 en C4 depositie zal optreden als de patiënt serum bevat een aanvulling op het activeren van anti-RBC antistoffen. Om RBC lysis te voorkomen door downstream complement activatie een blokkerende anti-C5 monoklonaal antilichaam wordt toegevoegd. Vervolgens wordt C3 en C4 depositie op RBC gedetecteerd door FACS met fluorescent gemerkte monoklonale antilichamen of Fab-fragmenten reageren met C3 en C4, respectievelijk. Gating in enige RBC is belangrijk om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen. Voordelen van deze techniek zijn dat een kleine hoeveelheid patiënt materiaal nodig complementactivering in een vroeg stadium van de cascade wordt beoordeeld en de methode reproduceerbaar en kwantitatief. Een bijkomend voordeel van naar zowel C3 en C4 is dat onderscheid kan worden gemaakt tussen de klassieke en lectine-route activering (zowel C3 en C4 depositie) en de alternatieve route activering (alleen C3 depositie). Het gebruik van bromelaïne behandelde RBC plaats van onbehandelde erytrocyten verhoogt de gevoeligheid van de alszeggen.
De tweede test is gebaseerd op de momenteel gebruikte hemolytische test (Figuur 1B). Human-bromelaïne behandelde type 0 RBC worden geïncubeerd met hitte-geïnactiveerd serum patiënt (anti-RBC antilichaam bron) en verse AB-serum (complement bron). Als complement geactiveerd door de patiënt anti-RBC antilichamen, zal dosisafhankelijk RBC lysis optreden, waardoor vrij hemoglobine. De hoeveelheid vrijgekomen hemoglobine wordt gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij 414 nm in het supernatant na stoppen met draaien de intacte en gefragmenteerde RBC. De absorptie correleert met de hoeveelheid hemolyse plaatsgevonden. In tegenstelling tot de momenteel gebruikte assay Dit protocol maakt een objectieve kwantitatieve waarde van hemolyse dat zeer reproduceerbaar en onafhankelijk van de persoon die de interpretatie van de test.
Een toepassing van deze werkwijzen is beschreven in 11, waarbij het mogelijke gebruik van C1-inhibitor complement inhibitor in AIHA was studied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bovenstaande tests zijn reproduceerbaar en robuust. Ze zijn eenvoudig uit te voeren en het is mogelijk om ze uit te voeren met veel monsters tegelijk (een 96 putjes plaat). Daarom zou deze aanpak ook geschikt voor een volledig geautomatiseerd systeem, bijvoorbeeld een ELISA-robot systeem. In tegenstelling tot de momenteel gebruikte technieken, deze tests zijn kwantitatieve en dit zal helpen bijvoorbeeld in de studie van het effect van complement inhibitors. Bovendien is de interpretatie doel, namelijk …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ en DW krijgen een onbeperkte subsidie van Viropharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
Riferimenti
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
