Metoder för kvantitativ detektion av antikroppsinducerad komplementaktivering på röda blodkroppar
Summary
Här beskriver vi två analyser för mätning av komplementaktivering inducerad av antikroppar mot röda blodkroppar. Den stora fördelen över de aktuella analyserna är deras kvantitativa och lätt att tolka naturen.
Abstract
Antikroppar mot röda blodkroppar (RBC) kan leda till komplementaktivering vilket resulterar i en accelererad clearance via komplementreceptorer i levern (extravaskulär hemolys) eller som leder till intravaskulära lys av de röda blodkropparna. Alloantikroppar (t.ex. ABO) eller autoantikroppar mot RBC antigener (som sett i autoimmun hemolytisk anemi, AIHA) leder till komplementaktivering är potentiellt skadliga och kan vara – speciellt när leder till intravaskulära lys – fatal 1. För närvarande, komplementaktivering på grund av (auto)-antikroppar på RBC utvärderas in vitro med hjälp av Coombs test reflekterar komplement nedfall på RBC eller genom en nonquantitative hemolytisk analys avspeglar RBC lys 1-4. Men för att bedöma effekten av komplementhämmare, är det obligatoriskt att ha kvantitativa metoder. Här beskriver vi två sådana tekniker. För det första är pre en analys för att detektera C3 och C4 avsättning på röda blodkroppar som är inducerade av antikroppar i patientserumpresenteras. För detta är FACS-analys används tillsammans med fluorescensmärkta anti-C3-eller anti-C4-antikroppar. Därefter görs en kvantitativ hemolytisk analys beskriven. I denna analys, komplementmedierad hemolys inducerad av patientserum mäts som utnyttjar spektrofotometrisk detektion av den frigjorda hemoglobinet. Båda dessa analyser är mycket reproducerbar och kvantitativ, underlätta studier av antikropp-inducerad komplementaktivering.
Introduction
Antikroppar mot röda blodkroppar (RBC) kan induceras genom transfusion av röda blodkroppar som uttrycker ett antigen som inte finns på mottagarens röda blodkropparna. Dessa allo antikroppar kan orsaka allvarliga akuta hemolytiska transfusionsreaktioner på grund av komplementaktivering på följande transfusion 5. I autoimmun hemolytisk anemi (AIHA), patienter har autoantikroppar mot sina egna röda blodkropparna. Detta leder till snabbare avslut av celler via interaktion av IgG bundet till röda blodkroppar med Fcy-receptorer på fagocyter i mjälten och / eller, i händelse av auto-antikroppar som kan aktivera komplement via komplementreceptorer i levern 6,7. Fulminant komplementaktivering som resulterar i intravaskulär hemolys är sällsynt men ofta dödlig. Accelerated, komplement medierad RBC förstörelse inducerad av antingen allo-eller autoantikroppar ger akut blodbrist och därmed potentiellt dödlig hypoxi. De autoantikroppar i AIHA klassificeras i varma och kalla antikroppar, depending på den optimala temperaturen de binder till röda blodkroppar (37 ° C eller lägre, respektive). De varma antikroppar vanligtvis av IgG isotyp och kalla antikroppar av IgM isotyp 8,9. AIHA kan vara sekundära till t.ex. lymphoprolyferative sjukdomar, bindvävssjukdomar, solida tumörer, infektioner eller droger, men i 50% av fallen AIHA är idiopatisk 9.
Detektion av gammaglobuliner (t ex. IgG-eller IgM) och komplement bundet till patientens RBC genomföres med hjälp av en semikvantitativ direkt antiglobulin (Coombs)-testet (DAT). I DAT patientens röda blodkropparna inkuberas med anti-IgG-eller anti-C3d. Förekomst av RBC agglutination påvisar förekomst av bifogade komplementkomponenter eller IgG-bindning. Detektion av allo-eller autoantikroppar i patientens serum utföres medelst indirekt antiglobulintest (IAT). I IAT är bromelain-behandlade prov RBC inkuberades med patientserum, tvättades och inkuberades sedan med anti-Human IgG. Vid RBC har sensibiliserats med anti-RBC-IgG närvarande i patientens serum agglutination kommer att ske. IgM-antikroppar mot röda blodkroppar kommer direkt att leda till agglutination vid inkubation av bromelain-behandlade prov RBC med patientserum. RBC agglutination i direkt Coombs test eller i IAT är visuellt bedöms antingen genom ögat i ett provrör eller genom att ladda provet på en liten Sephadex kolonn separera agglutinerade och enstaka röda blodkropparna efter storlek 1.
En annan ofta använd teknik för att mäta komplementaktivering på röda blodkroppar är det hemolytiska analysen 1, i vilken kapaciteten hos patientserum för att inducera (komplementmedierad) hemolys av bromelain-behandlade röda blodkroppar 10 bedöms. Testet noteras som positivt när supernatanten efter centrifugering är färgade röda på grund av utsläppt hemoglobin och anses vara negativt om det förblir färglös. Både antiglobulintestet och hemolytiska analysen är semikvantitativ, eftersom den högsta Serum späd betecknas där testet är fortfarande positivt.
Den antiglobulintest och hemolytiska analysen är robusta analyser som rutinmässigt används i diagnostik. Eftersom dessa analyser är semikvantitativ och beroende på erfarenheterna av teknikern som utför analysen de inte är lämpliga att studera subtila skillnader i komplementaktivering på RBC, som behövs vid utvärderingen av effekten av komplementhämmare. Därför utvecklade vi två kvantitativa analyser för att avgöra komplementaktivering av (auto-) antikroppar mot röda blodkroppar, vilket vi kommer att beskriva i denna uppsats.
Först utvecklade vi en analys för att mäta nedfallet av aktiverings fragment av komplement C3 och C4 på röda blodkropparna (Figur 1A). I denna analys är humana bromelain-behandlade typ-0 RBC inkuberades med värmeinaktiverat patientserum (anti-RBC-antikropp-källa), färska AB-serum (komplementkälla) och anti-C5 monoklonala antikroppen (Eculizumab). Under denna incubation kommer C3 och C4 nedfall uppstå om patienten serum innehåller komplement aktivera anti-RBC-antikroppar. För att förhindra att RBC-lys genom nedströms komplementaktivering en blockerande anti-C5 monoklonala antikroppen tillsätts. Härnäst C3 och C4 avsättning på RBCs detekteras genom FACS med användning av fluorescensmärkta monoklonala antikroppar eller Fab-fragment som reagerar med C3 och C4, respektive. Gating på enstaka röda blodkroppar är viktigt att säkerställa tillförlitligheten i resultaten. Fördelar med denna teknik innefattar att en liten volym av patientmaterial krävs, komplementaktivering i ett tidigt skede av kaskaden bedöms och metoden är reproducerbar och kvantitativ. En ytterligare fördel med att titta på både C3 och C4 är att kan man skilja mellan det klassiska och lektin väg aktivering (både C3 och C4 nedfall) och den alternativa vägen aktiveras (endast C3 nedfall). Användningen av bromelain-behandlade röda blodkroppar i stället för obehandlade RBC ökar känslighet somsäga.
Den andra analysen är baserad på den för närvarande använda hemolytiska analysen (Figur 1B). Mänskliga bromelain behandlad typ-0 RBK inkuberas med värmeinaktivpatientserum (anti-RBC antikroppskälla) och färsk AB-serum (komplementkälla). Om komplement aktiveras av patientens anti-RBC-antikroppar, kommer dosberoende RBC lys uppstå, vilket leder till frisättning av hemoglobin. Mängden utsläppt hemoglobin kvantifieras genom att mäta dess absorbans vid 414 nm i supernatanten efter spinning ner de intakta och fragmenterade RBK. Absorbansen korrelerar med mängden uppstått hemolys. I motsats till den för närvarande använda analysen, ger detta protokoll för en objektiv, kvantitativ värde på hemolys som är mycket reproducerbar och inte är beroende av den person som tolkar analysen.
En tillämpning av dessa metoder har beskrivits i 11, där den potentiella användningen av C1-inhibitor som komplementhämmare i AIHA var studied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovanstående analyser är reproducerbar och robust. De är lätt att utföra och det är möjligt att utföra dem med många prover samtidigt (i en 96-brunnars platta). Därför skulle detta synsätt också vara lämpliga för ett helautomatiskt system, t.ex. ett ELISA robotsystem. I motsats till de för närvarande använda tekniker, är dessa analyser är kvantitativ och detta kommer att hjälpa till exempel i studien av effekten av komplement-inhibitorer. Dessutom är tolkningen syfte, vilket är en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ och DW får en obegränsad bidrag på ViroPharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
Riferimenti
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
