Metoder til kvantitativ påvisning af antistof-induceret komplement aktivering på de røde blodlegemer
Summary
Her beskriver vi to assays til måling af komplement aktivering induceret af antistoffer mod røde blodlegemer. Den største fordel i forhold til de aktuelle analyser er deres kvantitative og let at fortolke naturen.
Abstract
Antistoffer mod røde blodlegemer (RBC) kan føre til komplement-aktivering resulterer i en accelereret clearance via komplement-receptorer i leveren (ekstravaskulære hæmolyse) eller fører til intravaskulær lysering af RBC'er. Alloantistoffer (fx ABO) eller autoantistoffer for RBC antigener (som set i autoimmun hæmolytisk anæmi, AIHA) fører til komplement-aktivering er potentielt skadelige og kan – især når der fører til intravaskulær lysis – fatal 1. I øjeblikket supplere aktivering på grund af (auto)-antistoffer på RBC er vurderet in vitro ved hjælp af Coombs test reflekterende komplement aflejring på RBC eller af en nonquantitative hæmolytisk assay afspejler RBC 1-4. At vurdere effekten af komplement-inhibitorer, er det imidlertid obligatorisk at have kvantitative teknikker. Her beskriver vi to sådanne teknikker. Først et assay til påvisning af C3 og C4 aflejring på røde blodlegemer, der er induceret af antistoffer i patientens serum er præsenteret. Til dette er FACS-analyse anvendes med fluorescensmærkede anti-C3-eller anti-C4-antistoffer. Dernæst er en kvantitativ hæmolytisk assay beskrevet. I dette assay komplement-medieret hæmolyse induceret af patientserum måles gør brug af spektrofotometrisk detektion af frigivet hæmoglobin. Begge disse assays er meget reproducerbare og kvantitative lette undersøgelser antistof-induceret komplement-aktivering af.
Introduction
Antistoffer mod røde blodlegemer (RBC) kan induceres ved transfusion af RBC udtrykker et antigen, som ikke er til stede på modtagende RBC'er. Disse-alloantistoffer kan forårsage alvorlige akutte hæmolytiske transfusion reaktioner på grund af komplement-aktivering på den følgende transfusion 5.. I autoimmun hæmolytisk anæmi (AIHA), patienter har auto-antistoffer mod deres egne RBC. Dette fører til accelereret clearance af celler via interaktion af IgG bundet til RBC med Fcy-receptorer på fagocytter i milten og / eller i tilfælde af auto-antistoffer i stand til at aktivere komplement via komplement-receptorer i leveren 6,7. Fulminant komplementaktivering resulterer i intravaskulær hæmolyse er sjældne, men ofte fatale. Accelereret, supplerer medieret RBC ødelæggelse fremkaldt af enten allo-eller Autoantistoffer resulterer i akut blodmangel og dermed potentielt dødelig vævshypoksi. Auto-antistoffer i AIHA er klassificeret i varme og kolde antistoffer depending på den optimale temperatur de binder sig til RBC (37 ° C eller lavere, henholdsvis). De varme antistoffer er sædvanligvis IgG isotype og kolde antistoffer af IgM-isotype 8,9. AIHA kan være sekundær til f.eks lymphoprolyferative lidelser, bindevævssygdomme, solide tumorer, infektioner eller narkotika, men i 50% af tilfældene AIHA er idiopatisk 9.
Påvisning af gammaglobuliner (IgG eller IgM f.eks.) Og supplere bundet til patientens RBC'er udføres ved hjælp af en semikvantitativ direkte antiglobulintest (Coombs) test (DAT). I DAT patient RBC inkuberes med anti-IgG eller anti-C3d. Forekomst af RBC agglutination viser tilstedeværelsen af vedlagte komplement komponenter eller IgG binding. Påvisning af allo-eller autoantistoffer i patientens serum udføres ved hjælp af den indirekte antiglobulintest (IAT). I IAT er bromelain-behandlede test RBC'er inkuberet med patientens serum, vasket og derefter inkuberet med anti-hUman IgG. I tilfælde af RBC er blevet sensibiliseret med anti-RBC IgG til stede i patientens serumagglutinationsproeve vil forekomme. IgM antistoffer mod RBC direkte vil føre til agglutination ved inkubation af bromelain-behandlede test RBC med patient serum. RBC agglutination i direkte Coombs test eller i IAT visuelt bedømmes enten ved øjet i et reagensglas eller ved at indlæse prøven på en lille Sephadex søjle adskille agglutineres og enkeltværelser RBC ved størrelse 1.
Et andet ofte anvendt teknik til at måle komplementaktivering på RBC er hæmolytisk assay 1, hvor kapaciteten af patientserum til at inducere (komplement-medieret) hæmolyse af bromelain-behandlede RBC 10 vurderes. Prøven betragtes som positivt, når supernatanten efter centrifugering farves røde på grund af frigivet hæmoglobin og anses for at være negativ, hvis den forbliver farveløs. Både antiglobulintest og hæmolytisk assay er semikvantitative, idet den højeste serum fortynding betegnes, hvor testen er stadig positiv.
Antiglobulintest og hæmolytisk assay er robuste assays, der rutinemæssigt anvendes i diagnostik. Da disse analyser er semikvantitativ og afhængig af oplevelsen af den tekniker, der udfører analysen, de er ikke egnet til at studere subtile forskelle i komplement aktivering på RBC, efter behov, når at evaluere effekten af komplement-hæmmere. Derfor har vi udviklet to kvantitative analyser til at bestemme komplement-aktivering af (auto-) antistoffer til RBC, som vi vil beskrive i dette dokument.
Først udviklede vi en analyse for at måle nedfald af aktivering fragmenter af komplement C3 og C4 på RBC (figur 1A). I dette assay humane bromelain-behandlede type 0 RBC inkuberet med varmeinaktiveret patientserum (anti-RBC-antistof kilder), frisk AB-serum (komplement kilde) og anti-C5 monoklonalt antistof (Eculizumab). I løbet af denne incubation vil C3 og C4 aflejring, hvis patienten indeholder serum supplement aktiverende anti-RBC-antistoffer. For at forhindre RBC ved nedstrøms komplementaktivering tilsættes et blokerende anti-C5-monoklonalt antistof. Dernæst C3 og C4 aflejring på RBC påvises ved FACS under anvendelse af fluorescens-mærkede monoklonale antistoffer eller Fab-fragmenter, der reagerer med C3 og C4, hhv. Gating på enkelt RBC er vigtigt at sikre pålideligheden af resultaterne. Fordelene ved denne teknik omfatter, at en lille mængde af patient-materiale er påkrævet, komplementaktivering på et tidligt stadium af kaskaden vurderes og fremgangsmåden er reproducerbare og kvantitative. En yderligere fordel ved at kigge på både C3 og C4 er, at der kan skelnes mellem den klassiske og lectin pathway aktivering (både C3 og C4 deposition) og den alternative vej aktivering (kun C3 deposition). Anvendelsen af bromelain-behandlede RBC stedet for ubehandlede RBC'er øger følsomheden af det somsige.
Det andet assay er baseret på den aktuelt anvendte hæmolytisk assay (figur 1B). Humane bromelain-behandlede type 0 RBC inkuberes med varmeinaktiveret patient serum (anti-RBC antistof source) og frisk AB serum (komplement kilde). Hvis komplement aktiveres af patientens anti-RBC-antistoffer, vil dosisafhængig RBC forekomme, hvilket fører til frigivelse af hæmoglobin. Mængden af frigjort hæmoglobin kvantificeres ved at måle dets absorbans ved 414 nm i supernatanten efter centrifugering ned de intakte og fragmenterede RBC. Absorbansen korrelerer med mængden af forekom hæmolyse. I modsætning til den aktuelt anvendte assay denne protokol giver mulighed for en objektiv, kvantitativ værdi af hæmolyse, som er meget reproducerbar og ikke afhængig af den person, der fortolker analysen.
En anvendelse af disse metoder er blevet beskrevet i 11, hvor den potentielle anvendelse af C1-inhibitor som komplementinhibitor i AIHA var studied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovenstående analyser er reproducerbare og robust. De er nemme at udføre, og det er muligt at udføre dem med mange prøver på samme tid (i en plade med 96 brønde). Derfor vil denne fremgangsmåde også være egnet til en fuldt automatiseret system, fx et ELISA robotsystem. I modsætning til de for tiden anvendte teknikker, disse assays er kvantitative og dette vil hjælpe fx i undersøgelsen af virkningen af komplement-inhibitorer. Desuden fortolkning er objektiv, hvilket er en forbedring i forhold…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ og DW modtage en ubegrænset tildeling af ViroPharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
Riferimenti
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
